Access Agilent 电子期刊（2016 年 8 月）

质量源于设计 (QbD) 的方法开发方式能在极短的时间里获得稳定的肽谱分析方法

作者：Sreelakshmy Menon 及 Suresh Babu C.V.
安捷伦应用科学家

作者：Richard Verseput
S-Matrix 公司总裁

肽图分析是最常用的一种蛋白质鉴定测试方法，使用正确的工具可加速稳定方法的开发。在质量控制中，分析人员通常使用反相液相色谱和紫外检测器进行肽图分析。传统液相方法开发过程中的一个主要挑战是，采用一次改变一个因素的方法进行多种色谱条件筛选时，会消耗大量的时间。在本文中，我们使用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱以及 Fusion QbD 方法开发软件，展示了一种更快的质量源于设计 (QbD) 方法。我们使用这些工具开发了一种稳定的单克隆抗体 (mAb) 胰酶消化物分析方法。

自动化分析可给出确定了最佳液相条件的报告

本研究中，QbD 工作流程包含两个阶段：1) 筛选，2) 方法优化。在每个阶段，Fusion QbD 软件会根据指定的变量输入组，生成一个统计学实验设计。可将生成的设计导出至 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版获得随时可执行的序列和方法，然后在 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相系统中运行。软件可将色谱数据导入并建模，最后自动生成报告，给出满足性能要求下的最佳条件。

第一阶段中，我们采用一般梯度筛选色谱柱和溶剂的组合。[1] 目的是根据特定的关键方法参数 (CMP) 确定可实现最多肽段峰分离的条件。筛选结果表明 Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱：筛选结果显示安捷伦 AdvanceBio 肽图分析色谱柱和乙腈组合是最佳条件，可分离最多的色谱峰，切线分离度 ≥ 1.5 和 2。

软件可预测稳定的最终设计空间

第二阶段是方法优化，使用了筛选研究得出的最佳条件。在该阶段，我们通过进一步优化泵流速、梯度斜率、添加剂浓度和其它因素对方法进行微调。然后，应用最终的优化方法创建设计空间。

图 1. 设计空间（无阴影区域）和 PAR 矩形四点 A、B、C、D 以及中间点 T 展示了可接受的柱温箱温度范围和中间保持时间

图 2. 更多色谱峰分离：比较 QbD 优化前后的色谱图以及分离度

设计空间指的是由 QbD 软件预测所得的主要区域，以 CMP 的形式定义关键方法属性 (CMA)。为了建立稳定的最终设计空间，其中重要的一步是在平均性能设计空间中，定量分析所有可能方法的稳定性。为此，您可使用 Fusion QbD 方法开发软件的稳定性模拟器表征方法参数对方法变异性的独立及联合效应。为了预测最终的稳定设计空间，软件会生成一个图片展示所研究的变量对肽段混合物分离的联合效应。图 1 展示了软件生成的图片示例。其中显示了设计空间和经证明可接受范围 (PAR)，该范围描述了可获得最多肽段峰数的稳定区域。

自动化的方法导出和执行减少了工作量

为了确证优化后的方法，我们使用 Fusion QbD 软件中的点预测功能自动从 PAR 矩形中导出所有验证方法至安捷伦 OpenLAB 中，以实现自动化操作。查看所有点预测的研究后，结果证实所得的所有数值均在预测范围内（± 2 sigma 置信限度）。重复进样用以评价方法的重现性，并随机选取色谱图中的五个峰，计算相对标准偏差百分比 (%RSD)。想要了解所有详细信息，请查看安捷伦应用简报 5991-6338EN。

比较初始筛选研究中所得的色谱图与经 QbD 优化所得最终方法的色谱图可以发现，可实现良好分离的肽段峰数大大增加（图 2）。

显著缩短分析时间

我们的测试结果显示采用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱联合 QbD 方法进行肽图分析方法开发可大大节省时间。Fusion QbD 软件的多元实验设计和分析能力结合 Agilent OpenLAB CDS 实验自动化技术，可为 mAb 的肽图分析提供一个稳定的分析方法，且时间相比人工方法开发会大大缩短。

如需了解更多有关我们的 QbD 方法和方法开发的相关内容，请查看安捷伦应用简报 5991-6338EN。