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Access Agilent 电子期刊（2016 年 1 月）

使用 Agilent 8800 ICP-MS/MS 快速、准确地对蛋白质和抗体进行绝对定量分析

Philippe De Raeve
比利时质量协助合同研究机构科学总监

Amir Liba
安捷伦美国 SPSD 应用化学家兼团队经理

在生命科学研究中，由于许多化合物都属于未知物质，因此能够对蛋白质和多肽进行准确定量分析且无需特定化合物标准品的分析方法极为有用。

现存在一种新型蛋白质定量分析技术，该技术使用电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 通过蛋白质中所含杂元素的信号响应来测定蛋白质浓度。串联四极杆 ICP-MS (ICP-MS/MS) 能够在 MS/MS 模式下运行，可有效去除质谱重叠。这样可对多种元素的多个同位素进行分析，实现了同位素稀释质谱 (IDMS) 分析。通过对加入了已知同位素组分认证标样的样品混合物进行测量，IDMS 可基于所测杂元素的同位素比对目标化合物进行定量。由于每个样品的浓度是通过同位素比独立测得（无需参考外标），因此 IDMS 可在无需使用化合物特定校准标样的情况下用于定量化合物，从而可准确定量未知蛋白质和多肽。

通过安捷伦解决方案进行硫同位素比分析

大多数蛋白质的蛋氨酸和半胱氨酸残基含有硫元素。使用传统四极杆 ICP-MS 较难测定硫元素，因为硫元素具有较高的电离能 (10.4 eV)，致使灵敏度非常低，并且多个多原子离子的存在会增加所有硫同位素的质谱重叠，尤其在有机基质中更是如此。高分辨率 ICP-MS (HR-ICP-MS) 可用于分析硫元素，但该系统不仅仪器成本更高，而且在分离硫同位素和质谱干扰物所需的质谱分辨率下，该系统的离子传输效率下降了 90%。

通过采用 Agilent 8800 ICP-MS/MS 的 MS/MS 功能，我们开发了一种通过测量32S 和 34S 同位素来定量分析硫元素的高准确度 IDMS 方法。我们使用了质量转移模式，在该模式下，分析物离子与碰撞/反应池气体 O2 反应，并测量 M + 16 amu（即 m/z 为 48 和 50）处的同位素特异性 SO+ 子离子。

使用高准确度双同位素稀释 IDMS 技术解决灵敏度差异问题

由于富集的同位素加标溶液 (H234SO4) 是通过对固体 34S 粉末进行氧化制得的，因此加标溶液中 34S 的真实浓度必须使用双同位素稀释法通过反相 IDMS 测定。使用美国国家标准技术研究院 (NIST) 认证的含有天然硫同位素丰度的 SO4 溶液作为参比标样对加标溶液中的 34S 进行定量分析。双同位素稀释法 IDMS 还解决了 32S 和 34S 之间的任何灵敏度差异问题，即自动纠正了质量歧视。

使用 ICP-MS/MS 实现全方法验证

分析中，我们选择牛血清白蛋白 (BSA) 作为模型化合物来测试方法。BSA 的分子式为 C2932H4614N780O898S39，因此含有 1.833% S；NIST 认证的标准参比物质 (SRM) 927e BSA（7% 溶液）含有 67.38 ± 1.38 g/L (± 2.0 %) 的 S。称量几份不同重量的（根据表 1 所示水平）BSA SRM 进行消解和测量。使用 ICP-MS/MS 分析各份溶液，并使用 IDMS 测定硫浓度。表 1 中列出的结果显示了出色的准确度和精密度，回收率近乎 100% 且 RSD 小于 0.35%。

NIST 927e BSA 溶液的实际重量 (mg) BSA 的标称质量（mg，近似值） 硫（µg，近似值） 硫（µg/g，近似值） 平均回收率 (%) RSD (%) n
26.05; 24.67; 23.37 1.6 30 0.6 101.29 0.34 3
30.93; 32.09; 31.34 2.1 40 0.8 101.30 0.21 3
40.33; 40.19; 39.72;
39.60; 40.01; 40.30		 2.6 50 1.0 101.26 0.22 6
47.71; 48.30; 48.12 3.2 60 ℃ 1.2 101.17 0.13 3
55.56; 55.72; 56.03 3.7 70 1.4 101.17 0.12 3

表 1. 分析不同重量 NIST 927e BSA SRM 溶液的样品消解液

我们还从以下各方面对此分析方法进行了评估：

  • 潜在配方缓冲液成分的基质效应。存在各种独立组分和混合配方缓冲液时结果仍保持一致
  • 存在非蛋白硫元素时的准确度：
    • 硫酸盐。向 NIST BSA 927e 溶液中加入 SO4（约含 5% BSA 硫）。使用截止值为 3 KDa 分子量的滤膜对部分该溶液进行过滤，以分离各种潜在的低分子量含硫污染物。加标溶液的修正后 BSA 回收率为 99.6%，表明硫酸盐对该值没有影响。
    • 蛋氨酸。将蛋氨酸分别加入 NIST BSA 927e 和人免疫球蛋白 (IgG) 溶液中。将溶液过滤，并分别测量初始溶液和滤液中的蛋氨酸。表 2 中给列出的结果显示滤液中的蛋氨酸具有出色的回收率，分别为 99.1% 和 99.5%。这清楚地表明任何低分子量含硫分子的潜在污染都可通过过滤进行选择性去除。
NIST BSA 溶液 IgG 溶液
添加的蛋氨酸 (mM) 2.05 2.05
滤液中的蛋氨酸 (mM) 2.03 2.04
% 回收率 99.1 99.5

表 2. 蛋氨酸的回收率

分析曲妥单抗溶液的应用

曲妥单抗是一种单克隆抗体，可对人表皮生长因子受体 2（HER2/neu 受体）产生干扰。本应用中，我们使用 IDMS-ICP-MS/MS 方法测量含有曲妥单抗的溶液中的硫浓度。如表 3 所示，所得结果与预期值相符。

预期浓度 测得浓度 %RSD (n=3) % 回收率
硫 21 mg/mL 20.53 mg/g 0.02 97.8

表 3. 分析曲妥单抗溶液

使用 Agilent 8800 ICP-MS/MS 对生物分子进行准确的定量分析

配备 MS/MS 模式的 Agilent 8800 ICP-MS/MS 可为多种硫同位素提供高灵敏度并可有效去除干扰，实现了使用 IDMS 根据 34S/32S 比来测定硫元素。这样一来，就可通过蛋白质、多肽和抗体等生物分子的硫元素含量实现准确定量。如需了解本研究的更多详细信息，请下载应用简报 5991-6118EN。如需了解有关此次合作和质量保证 S.A. 公司的更多信息，请访问网站 www.quality-assistance.com。

安捷伦提供多种 ICP-MS 系统、附件和备件

安捷伦提供各种 ICP-MS 系统、附件和备件。请花几分钟时间了解 Agilent 8800 ICP-MS/MS 如何通过多种独特和功能强大的运行模式来提供出色的性能和灵活性。

通过安捷伦 ICP-MS 期刊及时了解最新进展

您是否对痕量金属分析感兴趣并希望了解 ICP-MS 领域的最新进展？敬请密切关注安捷伦的 ICP-MS 期刊。该期刊每年出版四次并提供 PDF 格式，若要查看最新一期的 ICP-MS 期刊和之前所有的过刊，请访问 ICP-MS 期刊存档。

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