Access Agilent 电子期刊（2016 年 1 月）

通过自动化生物制药工作流程解决方案将生物制剂快速推向市场

Vicki Pandey，安捷伦全球营销传播部门

生物重组蛋白是非常复杂的分子，需要特定的纯化技术、复杂的样品前处理以及通常更长的分析时间来获得所需的分离度和检测限。高通量平台和自动化工作流程是提高分析效率、增加通量和确保精密度的两种方式。在本文中，我们回顾了一些安捷伦自动化系统的实例，这些自动化系统能帮助您改善生物制剂推向市场的工作流程。

图 1. Agilent MassHunter BioConfirm 具有自动化的肽谱数据采集功能和分析工作流程

Agilent MassHunter BioConfirm 软件可实现自动化肽谱分析

肽谱分析实验可能包含数百种具有不同修饰的肽。自动化数据处理提升了数据挖掘的实验分析效率。图 1 展示了 Agilent MassHunter BioConfirm 软件提供的肽谱分析工作流程。在数据采集之后，系统将基于化合物的色谱特性自动提取化合物。然后将化合物表与具有可能修饰基团的理论肽消解物列表进行匹配。通过肽的 b/y 碎片对每个肽的 MS/MS 谱图进行解析。然后编译序列覆盖图，系统将在工作流程的最后自动生成肽谱分析报告。

在该示例中，我们使用配备 Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱的 Agilent 1290 Infinity LC 以及配备安捷伦喷射流技术的 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS。如需了解更多有关该自动化肽谱分析应用的信息，请下载安捷伦出版物 5991-3600EN。

Agilent AssayMAP Bravo 可平行处理样品且变异性低

分析人员必须快速准确地表征日益增多的潜在生物治疗蛋白质，以便制定基于数据的决策，使最佳候选药物快速通过药物发现和开发过程。这就需要在常规工作流程中减少样品瓶颈，转而需要更快速、可扩展和可重现的方法来替代当前的低通量和耗费劳力的手工方法。这些工作流程包括蛋白质纯化和定量、全蛋白质质量测定、序列覆盖分析以及翻译后修饰的表征。

Agilent AssayMAP Bravo 平台通过在多个 LC/MS 样品前处理工作流程中平行处理样品并提供低变异性和最少手动操作时间来解决这些问题带来的挑战。

图 2. 抗体样品前处理的工作流程

图 2 展示了 AssayMAP Bravo 上的样品前处理工作流程。样品盘中的 96 份样品（每份含 15 µg mAb）进行了亲和纯化、溶液内消解和肽纯化处理。LC/MS 针对六种蛋白质特异性肽段生成了提取离子色谱图，从中可以推测出相对蛋白质丰度。通过 EIC 色谱峰面积计算所得的所有 96 份样品的 CV 为 5%-8%，这表明整个工作流程的重现性非常高。

For this trial, replicates of mAb in particulate-free CCS were purified in parallel. The resulting peptides were purified and concentrated on C18 reversed-phase cartridges, resulting in samples ready for LC/MS analysis. We employed an Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC and 1290 Infinity LC equipped with Agilent Poroshell 300SB-C18 and AdvanceBio Peptide Mapping columns. A 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS with Agilent Jet Stream technology delivered the required sensitivity. Explore further in Agilent publication 5991-4872EN and see how you can avoid process bottlenecks.

安捷伦色谱柱可为复杂的糖链提供高分离度分析

对重组 EPO (rhEPO) 等生物药物的糖链谱图进行详细表征是非常有必要的，因为糖基化差异会影响生物药物的药效作用和药代动力学特性。选用的方法通常是亲水相互作用色谱 (HILIC)，并采用 2-氨基苯甲酰胺 (2AB) 对样品进行标记，以实现高灵敏度的荧光检测。

虽然 HILIC 可以根据流体力学半径实现糖链的高效分离，但它仍不足以对样品中具有分支结构糖链的复杂混合物（如 EPO 或胎球蛋白）实现完全分离。幸运的是，弱/强阴离子交换色谱 (WAX/SAX) 提供了高度正交的分离性能，它依靠糖链中酸性单糖的数量和排列实现分离。为了提高分离度并增大峰容量，可以将 WAX 与 HILIC 分离结合使用。首先，使用胎球蛋白对 WAX/HILIC 二维液相色谱设置进行测试。第一维分离采用 110 分钟的 WAX 梯度和 Agilent Bio WAX 色谱柱进行，然后时间为 30 秒的第二维 HILIC 分离采用 4.6 × 50 mm HILIC 色谱柱进行。

图 3. 胎球蛋白和 EPO 的 HILIC/WAX 全二维液相色谱分离结果展现了高度正交的分离性能。第二维的离子交换色谱揭示了糖链的电荷分布情况

全面的 HILIC/WAX 分离被用于在线二维液相色谱设置中，可保持高度正交的分离。图 3 展示了 HILIC/WAX 2D 分析的二维液相色谱图。二维分离提供了较高的峰容量和分离度，许多来自 HILIC 维度的共洗脱峰均可通过 WAX 色谱柱实现完全分离。

Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案与 1260 Infinity 荧光检测器以及 HILIC 和 WAX 色谱柱联用，可为治疗性糖蛋白中高度复杂的糖链提供出色的分离性能。如需查看更多详细信息，请参见安捷伦出版物 5991-5349EN。

安捷伦解决方案可加速生物制药发现和开发的进程

无论您希望增加样品通量、加快方法开发、自动化样品前处理，还是希望解决棘手的生物制药应用问题，安捷伦的高度模块化方法都能为您提供实现成功所需的灵活性。探索各种液相色谱工具和解决方案以及液质联用仪器，使几乎所有制药相关的液相色谱应用实现自动化。如需了解更多信息，请联系安捷伦客户服务中心，可帮助您确定适合您应用的正确工具。