案例研究：安捷伦客户合作开发出维生素 B12 吸收定量分析的稳定 LC-QQQ 方法

Sarita. D
圣约翰研究所研究员

Siji Joseph
安捷伦应用科学家

维生素 B12 也称为氰钴胺素，是一种水溶性微量营养素，常作为蛋氨酸合成酶 (MS) 和甲基丙二酰辅酶 A 变位酶 (MCM) 的辅酶 [1]。这种维生素的缺乏症在印度十分普遍，对几乎所有年龄段的人群都有影响 [2]。圣约翰研究所的科学家利用安捷伦三重四极杆液质联用技术对维生素 B12 的吸收进行测定。

缺乏维生素 B12 可能导致血液学和神经系统的并发症以及蛋氨酸循环功能不足，从而致使血浆中高半胱氨酸过高，其具有诱发心血管疾病发病的风险 [3,4]。另一个令人关注的领域是维生素 B12 缺乏对怀孕初期表观遗传学调控的潜在影响以及后续的成人慢性疾病的相关风险 [5]。需要对两个领域进行研究：一个是关于开发测量维生素 B12 吸收的灵敏方法，另一个是关于寻找维生素 B12 缺乏的敏感生物标记物。

¹³C 稳定同位素标记提供了可靠的定量分析

尽管有很多种测量维生素 B12 吸收的技术，但圣约翰研究所采用了¹³C 稳定同位素标记的方法。使用标记维生素的关键在于，在服用后测量血浆中标记维生素代谢物的浓度，并将其作为吸收指标。

图 1. 圣约翰研究所的研究人员使用安捷伦三重四极杆液质联用系统进行维生素 B12 的吸收研究

本研究中，圣约翰的研究人员使用安捷伦气质联用仪测量血浆中甲基丙二酸 (MMA) 和高半胱氨酸 (Hcy) 的浓度，将其作为低浓度维生素 B12 的指示物（图 1）。Hcy 含量会随着低叶酸含量的增加而增加，从而使维生素 B12 的检测复杂化， 且需要对其他生物标记物进行鉴定 [6]。一种策略是监测丙酰肉碱 (C3) 的积累，丙酸肉碱 (C3) 是在维生素 B12 缺乏期间出现的甲基丙二酸尿症和丙酸血症的标记物 [1]。然而，从复杂生物样品中测量这些生物标记物极具挑战。

安捷伦 LC-QQQ 可实现灵敏的生物标记物定量分析

圣约翰研究所使用微生物合成稳定的带有 ¹³C 标记的维生素 B12 ，并使用 安捷伦 LC-QQQ 对其进行表征。在啮齿动物模型中使用该示踪剂，利用它们对血浆中维生素及其代谢物的浓度进行表征。

图 2. MS/MS 谱图显示了 B12 和 ¹³C-B12 分子离子 (M+H)⁺ 的子离子

圣约翰研究所与安捷伦开展长期合作，他们利用安捷伦的应用支持和系统以最少的样品前处理对这些痕量代谢物进行研究。他们将 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统与配有安捷伦喷射流技术的 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统结合使用，对同位素标记的合成维生素 B12 进行表征，以研究其化学完整性和同位素分布。LC-QQQ 实验中得到的标记和未标记维生素 B12 子离子谱图如图 2 所示。圣约翰研究所已成功开发出分析方法，并积极地建立了一种基于代谢标记的准确、可靠的维生素 B12 吸收检测方法。

80% 的孕妇维生素 B12 水平偏低

圣约翰研究实验室是圣约翰医学医院的一部分，其重点关注孕期维生素 B12 缺乏问题。研究人员测量了 200 多名孕妇在孕期的前中后三个阶段（每个阶段为三个月，最重要的是第一个阶段）中血浆内维生素 B12 的含量，观察到约有 80% 的孕妇维生素 B12 含量偏低 (< 150 pmol/L)。评估其他生物标记物如丙酰肉碱 (C3) 及其与乙酰肉碱 (C3/C2) 和棕榈酰肉碱 (C3/C16) 的比率十分重要。这些比率与孕妇在孕期第一个阶段中维生素 B12 的含量呈现出负相关。[1]

他们目前正在设置所有代谢物的特征签名，用于帮助我们理解维生素 B12 缺乏，以便母亲们可以及时采取补救措施。在怀孕初期，建立这种基于代谢的方法预测维生素 B12 缺乏并了解维生素 B12 补充的应对措施十分重要。

未来计划：使用更灵敏的 QQQ 进行更多研究

为补充其代谢组学方法，圣约翰研究实验室购买了一台 Agilent 6495 三重四极杆液质联用系统用于进一步的生物标记物表征。他们旨在开发一种更灵敏、更精确的方法用于鉴定和定量分析生物标记物，以更好地了解维生素 B12 缺乏模式。

在要求严苛的生物标记物研究中获得出色的灵敏度

如果您的实验室必须以阿克到 zeptomole 级的检测限精确定量分析生物标记物，请观看关于配备 iFunnel 技术的 Agilent 6495 三重四极杆液质联用系统的相关视频。如需了解详情，请联系安捷伦客户服务中心。

仅限研究使用。不可用于诊断目的。

参考文献

1. Luciana Hannibal, Vegard Lysne, Anne-Lise Bjørke-Monsen, Sidney Behringer, Sarah C. Grüner, Ute Spiekerkoette, Donald W. Jacobsen, Henk J. Blom. “Biomarkers and Algorithms for the Diagnosis of Vitamin B12 Deficiency”. Front Mol Biosci. 2016; 3: 27. Published online 2016 Jun 27. doi: 10.3389/fmolb.2016.00027
2. Samuel T.M, Duggan C, Thomas T, Bosch R, Rajendran R, Virtanen S.M, Srinivasan K, Kurpad A.V, “Vitamin B12 Intake and Status in Early Pregnancy among Urban South Indian Women”, Ann Nutr. Metab.2013;62:113–122.
3. Miller A. L, “The methionine-homocysteine cycle and its effects on cognitive diseases”. Altern Med Rev. 2003 Feb;8(1):7-19.
4. Moelby L, Rasmussen K, Jensen K, Pedersen KO. “The relationship between clinically confirmed cobalamin deficiency and serum methylmalonic acid”. J Intern Med1990; 228:373-378.
5. Thomas A.B, “Textbook on Nutrition and Development, Short- and Long-Term Consequences of Health”, Published by Wiley-Blackwell, For British Nutrition Foundation.
6. Amos RJ, Dawson DW, Fish DI, Leeming RJ, Linnell JC. “Guidelines for the investigation and diagnosis of cobalamin and folate deficiencies”. Clin Lab Haematol1994; 46:101-115.

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文章目录 — 2017 年 1 月