Access Agilent 电子期刊（2016 年 7 月）

去除脂类以便使用 LC/MS/MS 分析血浆中的毒性化合物

Joan Stevens，安捷伦高级应用科学家

一种用于测定血浆中毒性化合物的便捷分析方法包括向小体积血浆中加入乙腈以引发蛋白质沉淀。将上清液移取至含有增强型脂质去除 (EMR–Lipid) 吸附剂的分散管中以去除 > 97% 的内源性血浆脂质基质组分。与竞品相比，安捷伦 EMR–Lipid 相比于测试的其他磷脂去除吸附剂，能够去除更多的脂质。分析物与加标血浆样品的分离准确度高于 95% 且平均相对标准偏差 (RSD) < 6%。

对于血浆样品，将蛋白质沉淀与 EMR–Lipid 分散 SPE 相结合，能够分离各种毒性化合物，并且基于方法性能，定量限 (LOQ) 为 1 ng/mL 或更低。该方法快速、简单，并且能够去除已知会保留在色谱柱上引起色谱异常和离子源污染的脂质。

经过毒理学监测的化合物的蛋白质沉淀和净化

本应用所介绍的实验使用含有抗凝剂 NaEDTA 或柠檬酸钠的血浆。利用酸化乙腈进行蛋白质沉淀，然后用安捷伦 EMR–Lipid 和增强型样品后处理（最终除脂萃取和干燥步骤）进行净化。使用具有各种疏水性和 pKa 且经过毒理学监测的 25 种不同化合物开展该实验（表 1）。

化合物	CAS 号	Log P	pKa
阿普唑仑	028981-97-7	3.02	1.79, 5.08
安非他明	000051-63-8	1.80	10.01
可卡因	000053-21-4	2.28	8.85
可待因	000076-57-3	1.34	9.19
苯二氮䓬	000439-14-5	3.08	2.92
海洛因	005893-91-4	1.55	9.10
氢可酮	000143-71-5	1.96	8.61
劳拉西泮	000846-49-1	3.53	12.46
盐酸 3,4-亚甲二氧基安非他命 (MDA)	013673-99-9	1.43	10.01
盐酸 3,4-亚甲基二氧基-N-乙基苯异丙胺 (MDEA)	116261-63-3	2.22	10.22
盐酸 3,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺 (MDMA)	092279-84-0	1.86	10.14
盐酸哌替啶	000050-13-5	2.46	8.16
美沙酮	001095-90-5	5.01	9.12
盐酸甲基安非他命	000051-57-0	2.24	10.21
硝西泮	000146-22-5	2.89	2.60, 3.28
奥沙西泮	000604-75-1	2.92	10.61, 12.47
羟考酮	000124-90-3	1.03	8.21
PCP 盐酸苯环利定	000956-90-1	4.49	10.64
芬特明	000122-09-8	2.08	10.25
普罗地芬	000062-68-0	5.61	8.96
士的宁	000057-24-9	0.93	9.27
替马西泮	000846-50-4	2.79	10.68
四氢大麻酚	001972-08-3	5.94	9.34
曲唑酮	025332-39-2	3.13	7.09
维拉帕米	000152-11-4	5.04	9.68

表 1. 具有各种疏水性和 pKa 且经过毒理学监测的 25 种不同化合物的 EMR-Lipid 分散 SPE 净化

利用更洁净的基质保持最优的色谱性能

对于生物样品而言，蛋白质沉淀是一种常用的样品前处理技术。尽管它能够去除萃取液中的蛋白质，但是脂质与目标分析物的共萃取可能引起色谱异常和质谱离子抑制。Agilent Bond Elut EMR–Lipid 可通过体积排阻和疏水相互作用选择性地去除脂质，且不影响分析物回收率。使用 LC/MS/MS 根据子离子 m/z 184 和 100 至 1000 的 MS1 监测磷脂。将色谱运行时间延长至 30 分钟以洗脱残留在色谱柱上并可能残留于离子源中的基质共萃取物。这些共萃取物在用于分析物分析的较短的快速梯度中不一定很明显，但是可在后续进样中洗脱，引起分析变异性。

图 1. 血浆样品经蛋白质沉淀和各种脂质去除吸附剂处理后的 LC/MS/MS 子离子 m/z 184

图 2. 从人体血浆中萃取的 25 种毒性化合物的准确度

图 3. 人体血浆中的 25 种毒性化合物的相对标准偏差 (RSD)

利用安捷伦 EMR 实现高效脂质去除

为比较安捷伦 EMR–Lipid 与其他市售磷脂去除吸附剂的脂质去除效率，将一份 500 µL 的血浆与 1 mL ACN (0.2 % FA) 混合以沉淀蛋白质，然后在真空作用下穿过磷脂萃取柱。图 1 表明安捷伦 EMR–Lipid 与常见的磷脂去除吸附剂（Waters Oasis Prime、Phenomenex Phree 和 Supleco HybridSPE）相比，可实现相当高效的脂质净化。图 3 是 10 ng/mL 加标血浆样品在经过蛋白质沉淀和 EMR–Lipid 分散 SPE 净化后动态 MRM 的代表性色谱图的叠加。

利用安捷伦 EMR—Lipid 实现更高的准确度和更轻松的重现性

通过以 5、25 和 50 ng/mL 的浓度将标准品加入血浆样品并重复进样五次 (n=5) 来测定准确度和重现性。然后对这些 QC 血浆样品进行蛋白质沉淀和 EMR–Lipid 分散净化。根据基质匹配校准曲线测定准确度。回收率和相对标准偏差如图 2 和图 3 所示。

结果表明所有化合物均获得了优异的回收率，5 ng/mL 下的平均回收率高于 95% 且 RSD < 6%。海洛因是唯一平均回收率相对较低 (65%) 的化合物，但是 RSD 低于 8%。

安捷伦微型化 EMR—Lipid 可优化血浆分析

使用蛋白质沉淀和安捷伦 EMR–Lipid 分散净化开发出一种用于分析各种毒性化合物的血浆 LC/MS/MS 的简单而廉价的样品净化方法。该新方法的优势在于：相比于标准 PPT 和市售脂质去除产品，可获得更洁净的萃取物，其中总脂质得到有效去除。优异的回收率和个位数 % RSD。无需额外的仪器或玻璃器皿即可获得明显更洁净的萃取物，提供了一种简单且用户友好的样品前处理方法。用于萃取血浆中的毒性化合物的这一方法易于应用于实验室，无需具备大量的样品前处理专业知识，因为它仅涉及加标、涡旋和离心。

安捷伦为有效的样品前处理提供一系列解决方案和产品

安捷伦的样品前处理产品能够助您实现分析目标。本文所讨论的应用利用 Agilent Bond Elut 增强型脂质去除 EMR—Lipid 技术分析血浆中的毒性化合物。我们证明了该技术能够有效萃取生物基质中的化合物，并获得了卓越的灵敏度，LOQ 等于或低于 1 ng/mL。有关新型 EMR—Lipid 方法的更多信息，请立即联系安捷伦客户服务中心。

仅限研究使用。不可用于诊断目的。

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