使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱进行聚乙二醇化蛋白质分析

M. Sundaram Palaniswamy，安捷伦高级应用科学家

聚乙二醇化指的是将聚乙二醇聚合物链与其它分子（通常是药物或治疗性蛋白质）形成共价结合的过程。将 PEG 的活性衍生物与目标大分子共同温育通常可实现聚乙二醇化。PEG 基团具备的多项优势有助于提高蛋白质稳定性并延长循环半衰期。美国食品药品监督管理局 (FDA) 已批准 PEG 为“公认安全物质” [1]。目前已有超过 10 种不同的聚乙二醇化产品通过了 FDA 的审批，更多具有潜力的产品正在开发中。PEG GCSF 是一种长效的重组 GCSF。推荐采用 SEC HPLC 技术测定纯度与更高分子量聚集体 [2]。

治疗性蛋白质的不理想吸附可对 SEC 产生干扰

多数针对 PEG GCSF 的已发布方法采用含有 100 mM NaCl、85% 磷酸以及最多 10% 乙醇的水相流动相以减少非特异性相互作用并改善峰形和分离性能 [3]。聚集体有时会比自然形态更易于与固定相结合，因此治疗性蛋白质的不理想吸附是 SEC 分析过程中的一个主要问题。由于这一优先结合趋势，聚集体的 SEC 分析往往并不准确，甚至存在无法检出的风险。使用含有机溶剂或极端 pH 的流动相可解决这一问题，结果表明这种流动相能够提高分离度和回收率。但除可能会使可逆聚集体解离外，这种流动相还可能会使配方缓冲液中不可逆的聚集体发生解离 [4]。

Agilent AdvanceBio SEC 与 1260 液相色谱仪具有出色的检测与分离能力

Agilent AdvanceBio SEC, 130 Å, 7.8 x 300 mm, 2.7 µm 色谱柱是一项用于 SEC 分析的突破性技术，采用了创新型硅胶填料和特有的亲水键合固定相。这款色谱柱可使各种样品均获得出色的分离度和体积分离，通常无需向流动相中添加有机改性剂。为证实这一功能，我们采用完全生物兼容、最高耐压达 600 bar 的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统，由以下几个模块组成：

• Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱泵
• Agilent 1260 Infinity 生物惰性高性能自动进样器
• Agilent 1200 Infinity 系列恒温器
• 包含生物惰性溶剂加热元件的 Agilent 1260 Infinity 柱温箱
• Agilent 1260 Infinity DAD VL（配置生物惰性标准流通池）
• Agilent AdvanceBio SEC, 130 Å, 7.8 x 300 mm 色谱柱，填充 2.7 µm 填料

本例所用的色谱参数如表 1 所示。

图 1. 完整治疗性 PEG GCSF 在 Agilent AdvanceBio SEC, 130Å, 7.8 × 300 mm, 2.7 µm 色谱柱上得到的 SEC 色谱图

图 2. 采用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱通过 SEC HPLC 测定出的 PEG GCSF 聚集趋势。(A) 完整 PEG GCSF 对照，(B) 55 °C 下温育 60 分钟，(C) 55 °C 下温育 120 分钟，(D) 55 °C 下温育 180 分钟

表 1. SEC HPLC 的色谱参数

结果与讨论

图 1 表明在该色谱条件下完整 PEG GCSF 可实现良好分离，表现为 5.989 分钟的单个对称峰。在本例中可明显看到共轭物包括二聚体和更高分子量的聚集体，如放大视图所示。然而，由图中不存在晚洗脱峰可以看出样品中不含游离 GCSF。

图 2 显示的经加热处理 PEG GCSF 的 SEC 图谱表明 AdvanceBio SEC 色谱柱可用于分离和检测聚集体。如色谱图所示，完整 PEG GCSF 与更高分子量的聚集体彼此实现了良好分离。PEG GCSF 单体和聚集体的相对定量结果以峰面积百分比形式列于表 4 中。

表 2. 根据峰面积得到的单体与聚集体的相对含量

数据清晰反映出，在 55 °C 下经过处理后，聚集体浓度有一定增大。而单体构型含量则相对有所减小，由 96% 分别减少至 70% 和 6.44%。

安捷伦针对您分析流程的每一阶段提供了多种解决方案

本文展示了一个采用 PEG GCSF 作为模型蛋白质进行聚乙二醇化蛋白质分析的出色的解决方案。文中开发出了一种采用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱，无需在流动相中添加有机改性剂即可监测 PEG GCSF 纯度的简单 SEC HPLC 方法。治疗性 PEG 蛋白质的应激研究表明 AdvanceBio SEC 色谱柱可对聚集体进行分离和检测，并能根据峰面积比进行定量分析。将这一简单的重现方法与仪器的生物惰性和耐腐蚀相结合，可使这类解决方案成为生物制药行业中聚乙二醇化蛋白质常规 QC 分析的可靠适用方法。

如需了解此应用包括更多数据的详细版本，请参阅安捷伦应用简报 5991-6791CHCN。也可以查看我们的文献、视频和在线研讨会，了解安捷伦解决方案如何帮助业务繁忙的实验室提高通量与效率。

参考文献：

1. Gaberc-Porekar, V, Zore, I, Podobnik, B, Menart, V. “Obstacles and pitfalls in the PEGylation of therapeutic proteins.” Current Opinion in Drug Discovery and Development, 11, 242–250 (2008).
2. ipc.nic.in/writereaddata/monoprepimages/Pefilgrastim-2961377726.pdf
3. Ratto JJ, O’Conner SR, Distler AR, Wu GM, Hummel D, Treuheit MJ, Herman AC, Davis JM. “Ethanol-sodium chloride-phosphate mobile phase for size-exclusion chromatography of poly (ethylene glycol) modified proteins.” Journal of Chromatography A 763:337–344. (1997).
4. Tsutomu Arakawa et al. “The Critical Role of Mobile Phase Composition in Size Exclusion Chromatography of Protein Pharmaceuticals.” Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 99, 1674–1692 (2010).

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文章目录 — 2016 年 7 月