Access Agilent 电子期刊，2016 年 4 月

使用 Agilent 2D-LC/MS 解决方案简化对华法令代谢物的非手性-手性分析

Smriti Khera
安捷伦制药部门市场经理

Siji Joseph
安捷伦应用科学家

生物基质中药物代谢物的分析非常具有挑战性，因为分析人员必须排除严重的基质干扰，以及应对高灵敏度和动态范围的需求。共洗脱可能带来另一个问题，因为氧化的代谢物经常是同重离子，在质谱碎裂方式上可能差别很小或没有差别，所以需要采用色谱或其他正交分离技术进行分离。

手性药物代谢物分析还存在另一个挑战，因为考虑到药物代谢和法规方面的要求，必须对手性代谢物异构体进行明确分离，并采用可重现的方法对其进行定性和定量。Agilent 1290 Infinity II 2D-LC 解决方案可提供应对这一困难分离问题的分离度。

手性和非手性药物代谢物的同时、立体定向分离

我们与印度班加罗尔百康-百时美施贵宝研究中心 (BBRC) 的科学家合作，开发了一种手性药物代谢物的分析方法。该方法采用的是二维液相色谱 (2D-LC) 与高分辨的 Agilent 6530 精确质量四极杆飞行时间 (Q-TOF) LC/MS 联用。2D-LC 非常适合这类应用，因为您可以在第一维中，对药物相关分析物与样品基质进行非手性分离，然后在第二维中进行手性分离。Agilent 1290 Infinity II 2D-LC 解决方案使生物分析人员可以非常轻松并可重现地进行二维色谱分离和方法开发。

华法令的研究凸显了 2D-LC 的优势

我们采用多中心切割 2D-LC 对华法令（香豆素）代谢物进行分析 [1]，华法令是一种使用了 50 多年的抗凝剂。采用 R- 和 S- 对映异构体的等量混合物进行给药。每种华法令对映异构体都可以通过形成几种活性和非活性立体异构氧化代谢物而被差异性清除。氧化的华法令代谢物质量数相同，许多都具有相似的 MS/MS 裂解方式。深入了解个体间华法令的代谢，对研究华法令治疗过程中剂量响应关系非常重要。我们和印度 BBRC 的科学家一起，用 Agilent 2D-LC/MS Q-TOF 研究华法令代谢物，对我们提出的工作流程进行概念验证。

对于这类困难的分离，我们在第一维中使用一根非手性反相柱，将五种非手性的羟基华法令彼此分开，并分离了母体华法令，以及基质干扰物。然后再通过多中心切割法，将每个羟基华法令转入第二维进行手性分离。该方法的详细信息可以在自选网络研讨会以及以往的 Access Agilent 文章中查到。[2]

在一次分析中成功地对立体异构体进行鉴定和定量

图 1. 采用 Agilent 2D-LC/Q-TOF 方法成功分离华法令及其羟基代谢物

图 2. 用一次色谱分离，分析外消旋 (R/S)、(R)- 和 (S)- 华法令与微粒体孵育不同时间形成羟基华法令的速率

图 3. 肝细胞孵育 24 小时的提取离子色谱图（下图）与混合标准品（上图）叠加。所有羟基化的代谢物都得到了准确鉴定和定量

图 1 显示，用我们的方法可以同时并立体定向地对所有 12 种华法令相关色谱峰进行基线分离。通过这一分离，可以准确地对每一个羟基华法令立体异构体进行鉴定和定量。该方法对所有分析物在三个数量级动态范围内呈线性，检出限 (LOD) 在单位数 nM 范围。对该方法的稳定性进行部分验证，得到了良好结果。

接下来，我们用这一方法对外消旋和手性华法令与人肝脏微粒体孵育得到的实际样品进行了分析。我们用贴壁肝细胞对外消旋华法令进行时间进程研究以及 24 小时孵育。结果令人惊讶。从每个时间点只进行一次的色谱分析中，我们可以测定所有代谢物的形成速率，以及母体药物的消失速率（图 2）。从这些速率中，我们可以计算中每个代谢物的固有清除率 (CLint)。

另外，用我们的方法只进行一次分析，即可通过保留时间和高分辨 Q-TOF MS 和 MS/MS 数据的组合（图 3），准确鉴定出实际代谢样品中的每个羟基华法令对映异构体。

全面分析的综合解决方案

我们先进的 Agilent 1290 Infinity II 2D-LC 解决方案与高分辨 Q-TOF 质谱仪相结合，为极具挑战性但在药物代谢研究团队中又是极为常见的分析问题提供了一流的解决方案。

如需了解该应用的更多信息，请观看免费的网络研讨会。从中发现新的技巧和工具，可以帮助您更快将药物推向市场。

参考文献

S. Joseph, M. Subramanian，S. Khera. Simultaneous and stereospecific analysis of warfarin oxidative metabolism using 2D LC/Q-TOF, Bioanalysis 2015, 7(18), 2297-2309.
S. Joseph, Multiple heart-cutting 2D-LC/ MS method for reproducible resolution of chiral drug metabolites（采用多中心切割 2D-LC/MS 方法重现性地分离手性药物代谢物）, Access Agilent, 2016 年 3 月.