액체 크로마토그래피/
질량 분석법 기초

일상적인 분석부터 신약 개발까지, LC/MS가 해냅니다.

질량 분석법은 두 가지 주요 질문에 대한 답을 제공합니다: “내 시료에 무엇이 있는가?” 그리고 “내 시료에 얼마나 있는가?”입니다. 필요한 선택성와 감도에 따라 다양한 유형의 LC/MS 시스템이 필요할 수 있습니다.

Single quadrupole

Single quadrupole LC/MS

사용하기 쉽고, 선택성이 높은 SQ LC/MS는 일상적인 정량 및 품질 관리 응용에 이상적입니다. 질량 검출을 기존 LC 검출기에 대한 대안, 또는 추가로 사용하면 여러 가지 이점이 있습니다. SQ LC/MS는 UV 검출보다 감도가 더 높을 수 있습니다. 이는 질량 대 전하비를 기준으로 구별할 수 있기 때문입니다. 또한 초임계 유체 크로마토그래피(SFC), 모세관 전기영동(CE), 이온 크로마토그래피(IC)와 같은 다른 분리 기술에 연결할 수 있습니다.

질량 분석기는 SIM 또는 스캔 모드에서 작동할 수 있습니다. 각 모드의 장점은 다음과 같습니다.

선택 이온 모니터링 모드(SIM)

SIM 모드에서 MS 파라미터는 몇 가지 특정 질량 대 전하비(m/z)를 모니터링하도록 설정됩니다. 이러한 특이성으로 인해 검출기는 각 표적 m/z 값을 더 오랜 시간 동안 샘플링할 수 있어 감도를 크게 높일 수 있습니다. 또한, 데이터 포인트 간의 사이클 시간이 스캔 모드보다 짧아지므로 최적의 피크 모양 프로파일링을 통해 정량 정밀도와 정확도가 향상됩니다.

샘플링할 m/z 값을 미리 설정해야 하므로, SIM은 표적 분석에 가장 많이 사용됩니다. 여러 표적 화합물로 구성된 분석의 경우 SIM 이온 샘플링 선택은 화합물의 용리 시간 범위에 맞춰 시간 프로그래밍할 수 있습니다.

SIM은 샘플링된 m/z 값 외에는 데이터가 수집되지 않기 때문에 정성 분석에는 거의 사용되지 않습니다.

스캔 모드

스캔 모드에서 기기는 짧은 시간(예: 2초) 동안 질량 범위(예: 50 ~ 2,000m/z)의 신호를 검출합니다. 이 스캔 시간 동안 MS는 전체 질량 범위가 포함될 때까지 더 좁은 질량 구간 내에서 검출된 신호를 순차적으로 판독합니다. 저장된 스펙트럼은 전체 질량 범위에 대해 검출된 신호를 나타냅니다. 전체 질량 스펙트럼이 기록되므로 스캔 모드는 일반적으로 정성 분석 또는 분석물의 질량을 미리 알 수 없는 경우 정량 분석에 사용됩니다.

시료는 인퓨전 또는 HPLC를 통해 MS에 도입될 수 있습니다. HPLC의 경우, 스캔 범위에 따라 피크 폭과 사이클 시간을 맞추는 것이 중요합니다. 피크가 좁을수록 적절한 피크 정의를 얻기 위해선 전체 사이클 시간이 짧아져야 합니다. 짧은 전체 사이클 시간을 얻으려면 스캔 범위를 줄여야 할 수도 있습니다.

Triple quadrupole

Triple quadrupole LC/MS

표적 고감도 분석의 경우, QQQ LC/MS가 최적의 기술입니다. 이는 tandem quadrupole 액체 크로마토그래피/질량 분석법, LC/MS/MS, LC/TQ 또는 LC/QQQ로도 알려져 있습니다.

높은 감도가 가능한 이유는 첫 번째 quadrupole(Q1)로 이온을 분리하고 충돌 셀에서 조각낸 다음 두 번째 quadrupole(Q2)에서 조각 중 하나를 분리할 수 있기 때문입니다. 이 기술은 MS/MS라고 불리며, 화학적 노이즈를 크게 줄이면서 관심 이온을 보존합니다.

다중 반응 모니터링(MRM)은 주로 사용되는 MS/MS 모드입니다. 특정 표적 화합물에 대한 높은 선택성과 감도를 제공하여 복잡한 매트릭스에서 표적 정량에 유용합니다. 작동 원리는 다음과 같습니다.

MRM 모드

전구 이온 선택: MRM에서는 관심 이온(전구 이온)을 필터링하도록 첫 번째 quadrupole을 설정합니다. 전구 이온은 선택 이온 모니터링(SIM) 실험과 유사하게 첫 번째 quadrupole을 통과합니다.
충돌 유도 분해(CID): 전구 이온이 충돌 셀로 이동함에 따라 에너지가 적용되고 비활성 가스 분자와의 충돌이 발생합니다. 이 과정을 충돌 유도 분해(CID)라고 부르며, 더 많은 이온 조각, 즉 생성 이온을 재현성 있게 생성합니다.
생성 이온 분리: 두 번째 quadrupole의 파라미터는 특정 생산 이온만 검출기로 통과하도록 설정됩니다. 이 다단계 과정은 MRM transition으로 알려져 있으며, 이는 표적 분석물질에 대해 매우 선택적입니다. 일반적으로 가장 풍부한 MRM transition은 정량을 위해 크로마토그램 전반에 걸쳐 측정되며 quantifier 또는 target transition이라고 합니다.
qualifier 전이의 추가: 분석법에 대한 확신을 높이고 신호가 의도한 표적에서 나온 것을 보장하기 위해, 분석물질에 특이적인 MRM transition을 추가할 수 있습니다. 이러한 추가 transition을 qualifier transition이라고 합니다. quantifier transition 외에 qualifier transition을 1개에서 3개 추가하는 것이 일반적입니다.
소프트웨어 도구를 통한 자동화: MRM 분석법 개발은 SIM 또는 스캔 분석법보다 더 복잡할 수 있습니다. 그러나 MassHunter Optimizer와 같은 소프트웨어 도구는 Agilent LC/MS/MS 기기에서 이 과정을 자동화합니다.

TOF(Time-of-flight)

TOF(Time-of-flight), 고분해능 질량 분석법

액체 크로마토그래피/사중극자-비행시간형 질량 분석법(LC/Q-TOF)은 뛰어난 분해능과 질량 정확도를 제공하여 LC/MS 및 LC/MS/MS에서 기록되는 단위 질량 측정과 차별화됩니다. LC/Q-TOF 기기는 화합물 식별에 유용한 풍부한 정보를 제공합니다.

LC/Q-TOF의 높은 분해능은 소수점 네 자리 이상의 정확한 질량 정보를 포함한 데이터를 생성합니다. 이 정밀도가 중요한 이유는, 원자의 질량이나 화합물의 분자량이 때때로 단순화된 설명에서 기술되는 정수가 아니기 때문입니다. 예를 들어, 산소의 정확한 질량은 15.9949 원자 질량 단위(amu)이지 16amu가 아닙니다.

측정된 질량과 이론 질량 사이의 일반적인 오차는 1에서 5ppm(백만 분의 1) 범위 내에 있으며, 이를 통해 질량이 매우 유사한 종을 구별할 수 있습니다.

고해상도 비디오와 유사하게, 고분해능 정밀 질량 분석법(HRAM)은 저분해능 LC/MS 및 LC/MS/MS에서는 흐릿하게 보이거나 병합되어 보일 수 있는 질량 스펙트럼의 세부 정보를 캡처하거나 정의합니다.

TOF(Time-of-flight) 분석기

TOF(Time-of-flight) 질량 분석기에서는 모든 이온에 동일한 전자기력이 동시에 가해져 이온이 비행 튜브를 통해 가속됩니다.

가벼운 이온은 더 빨리 이동하여 먼저 검출기에 도착합니다. 이온의 질량 대 전하비(m/z)는 도착 시간에 따라 결정됩니다.

TOF(Time-of-flight)질량 분석기는 넓은 질량 범위에서 이온을 분석하고 매우 정밀하게 도착 시간을 측정하여 높은 분해능을 구현할 수 있습니다.

Full scan 모드

Full scan 모드는 TTI(Total Transmission of Ions) 또는 TIC(Total Ion Chromatography)로도 알려져 있으며, LC/Q-TOF 시스템에서 일반적으로 사용됩니다. 이 모드는 quadrupole 분리 없이 모든 전구 이온이 비행 튜브를 통과하여 검출기에 도달합니다. 모든 정보가 캡처되므로 이 모드는 회귀 분석에 특히 유용합니다.

LC/Q-TOF 시스템은 또한 반표적 또는 완전 표적 모드에서 작동할 수 있으며, quadrupole 및 충돌 셀을 MS/MS 실험에서 사용하여 선택성을 향상시킵니다. 또한 일상적인 정량 분석을 위한 신뢰할 수 있는 측정을 제공합니다.

LC/MS 이온화원

거의 모든 LC/MS 이온화원은 중성 분자에 하전된 종을 첨가하는 원리로 작동합니다. 이러한 형태의 이온화는 분자 자체가 전자를 잃지 않는다는 점에서 GC/MS와 다릅니다. 대신 부가물을 얻을 수 있는데, 일반적으로 양이온의 경우 H+ 양성자를 얻거나, 음이온의 경우 양성자를 잃을 수 있습니다. 따라서 LC/MS는 시료 분석물을 분해하지 않고 이온을 생성할 수 있어 분석물의 온전한 질량을 검출할 수 있습니다. 이 프로세스를 소프트 이온화라고도 합니다.

분석물의 극성과 분자량에 따라 이온화원이 결정됩니다. 전자 분무 이온화(ESI)는 다중 전하를 띤 시료(예를 들어 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드)를 분석하는 데 유용합니다. 단일 전하를 띤 시료(저분자 약물, 농약, 대사체) 또한 분석할 수 있습니다. 대기압 화학 이온화(APCI)는 중간 분자량을 가진 다양한 극성 및 비극성 분석물에 적용 가능합니다.

전자 분무 이온화 Jet Stream 대기압 화학 이온화 멀티모드 이온화원

큰 분자와 작은 극성 분자를 부드럽게 이온화합니다

전자 분무 이온화(ESI)는 nebulizer를 사용하여 용매 흐름에서 미세한 에어로졸 스프레이를 생성하고 분석물 분자가 포함된 액체 방울에 전하가 유도합니다. 가열된 건조 가스가 에어로졸 스프레이를 감싸 용매가 증발(탈착)되도록 도와줍니다. 빠르게 증발하는 액체 방울과 증가하는 순 전하가 결합되어 "쿨롱힘 폭발"을 일으켜 개별 분석물 이온이 부가물과 결합하게 됩니다(예: [M + H]⁺, 양성자화된 분자). 이러한 이온들은 모세관 샘플링 오리피스를 통해 질량 분석기로 전달됩니다. ESI는 다중 전하 이온을 생성하는 능력이 뛰어나 매우 큰 분자(>150kDa)를 검출할 수 있습니다. 이는 극성 분석물질에 가장 적합합니다.

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다양한 시료 유형에서 감도를 극대화합니다

Agilent Jet Stream 고감도 이온화원(AJS)은 독점 기술로, 전자 분무 이온화를 기반으로 합니다. 초고온으로 가열된 질소를 사용해 액체 방울 탈용매화와 이온 생성을 개선하여 신호를 더 강화하고 노이즈를 감소시킵니다. 또한, 대부분 분석물에 대해 가장 높은 감도를 제공하며 표준 ESI에 비해 5배 이상 높은 반응을 보여줍니다.

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전자 분무에 적합하지 않은 화합물을 자신있게 분석하세요

대기압 화학 이온화(APCI)는 대기압에서 가열된 기화기(일반적으로 250 ~ 400°C)를 통해 LC 용출액을 분무하여 작동합니다. 이 때 발생한 기체 상태 용매 분자는 코로나 방전 니들에서 방출된 전자에 의해 이온화됩니다. 그런 다음 용매 이온은 화학 반응(화학 이온화)을 통해 분석물질 분자에 전하를 전달합니다. 이러한 분석물질 이온은 모세관 샘플링 오리피스를 통해 질량 분석기로 전달됩니다. APCI는 다양한 극성 및 비극성 분자에 적용 가능합니다. 열적으로 불안정할 수 있는 대형 생체 분자를 분석하는 데는 전자 분무보다 적합하지 않습니다.

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정보와 처리량 사이에서 절대 타협하지 않습니다

Agilent 멀티모드 이온화원(MMI)은 ESI와 APCI를 단일 이온화원으로 결합한 획기적인 LC/MS 기술입니다. 사실상 ESI 이온화원이 코로나 방전 니들로 분사되어 화학적으로 이온화된 종을 생성할 수 있습니다. 성능은 두 이온화원을 개별적으로 사용하는 것보다 약간 낮을 수 있지만, 비극성 및 극성 분석물질을 이온화원 교체나 가동 중단 없이 단일 이온화원을 통해 이온화할 수 있습니다. MMI는 ESI 전용, APCI 전용 또는 혼합 모드로 작동하여 높은 다목적성을 제공합니다.

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