环境新规全解读 | “绿水”长流？微囊藻毒素 On-line SPE – LC/QQQ 分析方法
连山变幽晦，绿水函晏温。 — 出自唐·柳宗元《饮酒》
江城回绿水，花月使人迷。 — 出自唐·李白《襄阳曲四首》
青苔寺里无马迹，绿水桥边多酒楼。 — 出自唐·杜牧《润州二首》
“绿水”是古今文人骚客惯用的经典意象之一，多用来形容山水美景。
有一种绿水，由淡水水体中蓝藻、绿藻、硅藻等大量繁殖引起，名为水华现象。而其中的蓝藻会产生一种天然毒素 — 微囊藻毒素（以下简称 MC），它具有肝毒性，可能引发肿瘤。不小心误饮此水，将严重威胁人体健康。
微囊藻毒素法规变迁
饮用水如长期暴露于微囊藻毒素下将会对人体健康造成极大威胁，这促使世界卫生组织（WHO）发布了 1 μg/L 的临时指南，以作为饮用水中微囊藻毒素-LG（游离加细胞结合）的最大浓度限值，并且许多国家地方政府直接采用了这一准则值。
随着近几年分析技术的不断进步，饮用水安全意识的不断加强，一些地区出台了极为严格的微囊藻毒素监管标准，尤其是城市供水系统，微囊藻毒素 RR 和 LR 的检出限均达到了 pg/ml 的浓度级别。
MC 的传统分析方法是采用 HPLC 进行紫外检测，面对如此严格的监管标准，虽然可以通过前处理的富集达到相应的检测浓度水平，但富集过程带来的操作误差和人工成本不能忽视。如果采用常规质谱或串联质谱直接进样的方式，pg/ml 浓度级别的检出限会给分析方法带来极大挑战。在这种情况下，针对低浓度检测，On-line SPE 与质谱的联用系统脱颖而出。
安捷伦微囊藻毒素分析方法
安捷伦分别基于 On-line SPE – LC/QQQ 与直接进样，成功开发了微囊藻毒素（包括 MC-RR，MC-HtyR，MC-LR，MC-HilR， MC-LA 和 MC-LF）的简单且灵敏的分析方法，这两种方法均能满足现今标准要求。
且通过两种实验对比得到，On-line SPE 方法不仅省去了耗时且费力的离线 SPE 萃取步骤，其灵敏度还提高了 100 倍以上，可作为未来微囊藻毒素检测的补充手段。
目标化合物
MC 是环肽，一般结构是环 [-D-Ala-R2-D-MeAsp-R4-Adda-D-Glu-Mdha-] ，其中 R2 和 R4 是可变的 L-氨基酸（图 1 和表 1） 。由于拥有两种可变氨基酸和其它氨基酸的甲基化/去甲基化，因此存在多种微囊藻毒素化合物，目前为止已鉴出超过 80 种微囊藻毒素。在本实验中，选择其中 6 种最流行的 MC 作为目标化合物。
图 1. 微囊藻毒素的分子结构式
表 1. 微囊藻毒素的相关信息
实验方法
On-line SPE 富集和洗脱时阀的位置、On-line SPE – LC/QQQ 方法和直接进样方法的色谱条件、质谱条件如图 2 和表 2-4 所示。
图 2. On-line SPE 富集和洗脱的阀位置
表 2. 直接进样 LC 采集方法
表 3. On-Line SPE 进样 LC 采集方法
表4. 质谱采集方法
结果与讨论
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分离效果：
图 3 显示了 On-line SPE – LC/QQQ 方法和直接进样方法进行 MCs 分析所得到的 MRM 色谱图，[M + 2H] 2+ 被选为 MC-RR 的前体离子，而 [M + H] + 被用作其它 MCs 的前体离子，Agilent Optimizer 软件对每个离子均进行了参数优化并提供最佳灵敏度。
图 3. HBCDs 及其同位素内标的 MRM 色谱图（1µg/L）
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线性、定量限和检出限数据：
采用直接进样法，MC-RR 在10 pg/ml - 100 ng/ml 范围内观察到良好的检测器响应线性：
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MC-HtyR、MC-HilR、MC-LA 和 MC-LF 为 50 pg/ml - 100 ng/ml
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MC-LR 为 100 pg/ml -100 ng/ml
而使用 On-line SPE 方法：
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MC-RR 的线性范围为 0.2 pg/ml -2 ng/ml
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MC-HtyR、MC-HilR、MC-LA 和 MC-LF 的线性范围为 1 pg/ml-2 ng/ml
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MC-LR 为 8 pg/ml-2 ng/ml。
由此可得到，On-line SPE 方法可得到更低的定量限和检出限。
表 5. 两种进样方法的定量限和检测限
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实际样品检测：
分别在中国四川省成都市区周边收集了三个地表水样本，通过 On-line SPE 方法分析得到一个阳性样本。重要的是，阳性样品只能通过 On-line SPE 方法定量，因为其浓度水平很低。而对于所有测试的 MCs，具有 10μL 进样体积的直接进样方法均未能达到检测限而被检出。
表 6. 实际样品的 MCs 检测结果（ND =未检测到）
小结
本文建立了用于定量测定微囊藻毒素（MCs）的简单且灵敏的方法。使用 Agilent 6470 三重四极杆系统，建立并比较了直接进样和 On-line SPE 方法。通过对比得到，直接进样方法获得的 LOQ 明显低于 WHO 为 MC-LR 浓度确定的临时指南值。对于地表饮用水，具有更低 LOQ 的 On-line SPE 方法可满足最近公布的严格的区域供水系统指导值。在实际样品测试中，MC-RR 和其它微囊藻毒素可从一个地表水样本中检测到，且由于其浓度水平较低，只能通过 On-line SPE 方法进行定量。
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