在色谱方法开发过程中，分离度、柱效、峰形是考察色谱柱选择性是否合适的主要性能指标。
方法开发中的分离度
根据分离度（Rs）公式，分离度的影响因素主要有柱效（N）、选择性（α）和保留因子（或称容量因子，k）：
公式1作为分离度改善的理论基础。通常，方法开发过程中，通过提高化合物保留 (k)、提高柱效 (N)、以及提升选择性 (α) 来达到分离度的改善。
选择性因子（α）：
式中 k1 和 k2 分别是第一个峰和第二个峰的保留因子。
根据公式 1 和公式 2，当选择性因子提高 0.1 时，对分离度的贡献是 Rs 大约为原来的 1.8 倍。因此选择性的改变对分离度的改善效果显著，如图 1 所示。
图 1. 分离度与柱效、选择性、保留因子的关系
与选择性有关的因素：
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固定相：选择不同化学修饰的键合相（不同的 C18 柱或其它键合类型色谱柱）
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流动相：调整有机相的类型、pH 值、盐浓度、两相比例等
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柱温
方法开发中的色谱柱选择
在色谱固定相的选择和使用中，最常用的键合相类型是十八烷基硅烷键合硅胶（C18）。不过，由于固定相物理特性与化学修饰的差异，使得不同的 C18 选择性不尽相同。选择色谱柱时，如果一种类型的 C18 柱分离度不足，就可以选择与之选择性差异较大的 C18 柱来进行优化。
以 Agilent InfinityLab Poroshell 系列中的 C18 液相色谱柱为例：
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Poroshell 120 EC-C18 为封端的碳十八固定相，对酸性、碱性、中性化合物都有良好的选择性，已经成为方法开发的首选，也是在 Agilent 1260 Infinity II 四元泵液相色谱系统中标配的色谱柱。
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与 EC-C18 柱不同，Poroshell 120 SB-C18 柱却是不封端的碳十八固定相。由于裸漏的硅醇基存在，可与待分离物发生氢键、离子间作用等，因此 SB-C18 的选择性与封端的 C18 柱存在显著差异。可以利用这个特点，在方法开发时 SB-C18 和 EC-C18 通常可以作为方法开发的起始色谱柱。另外，SB 的全称是 StableBond，顾名思义意为“稳定的键合相”，这里说的稳定，主要是在C18硅烷长链的两侧采用异丁基进行立体的保护，使得 SB-C18 在低 pH 下有较好的耐受性能。
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同样采用 Poroshell 120 的硅胶，HPH-C18 与 EC-C18 和 SB-C18 又有所不同。在进行键合之前，在 Poroshell 硅胶的表面多孔层，先进行了有机杂化处理，再进行 C18 键合和封端修饰，得到的 HPH-C18 色谱柱具有了高 pH 耐受的特点。
因此，表面化学结构的差异，三种常用的 Poroshell C18 柱，在选择性上具有显著区别。表 1列出了以 EC-C18 为基准，HPH-C18 与 SB-C18 的相似度因子 Fs。当 Fs 因子大于 3.0时，固定相选择性存在差异。
表 1. 三种固定相选择性差异比较（以 EC-C18 为基准）
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Poroshell 色谱系列在色谱分析行业已经得到了广泛的认可，安捷伦也一直在拓展 Poroshell 系列色谱柱的产品线。
2020 年 11 月，安捷伦推出了新产品 Poroshell CS-C18 柱，进一步拓展了 C18 固定相的类型。该固定相是在 Poroshell 实心核颗粒的表面多孔层在进行高 pH 耐受的杂化处理之后，再进行 C18 键合、封端和正电荷修饰，其中使用的键合相还进行了侧立基的保护。这样 CS-C18 固定相的表面，不仅具有 C18 提供的疏水作用、而且还具有正电荷的离子作用，选择性也与其它的 C18 键合相有显著差异。同时，硅烷链侧立基保护、多孔硅胶表面杂化处理，使得固定相pH耐受范围得到了拓宽。
在 Poroshell C18 的四种 C18 键合相中，涵盖了 RPLC 模式下的主要作用力，选择性彼此之间有显著差异，见图 2。利用这些固定相的选择性差异，可以方便地进行方法开发中的色谱柱选择。
图 2. Poroshell 的 4 种 C18 固定相
应用实例
碱性条件下选择性差异
在 pH=10 的体系下，耐碱的 CS-C18 与 HPH-C18 选择性存在显著差异。
图 3. 农药组分在碱性体系下 LC-MSMS 色谱图结果比较
酸性条件下选择性差异
在酸性体系下，不同 Poroshell C18 柱的保留、分离度有显著差异。
图 4. 阿片类药物在酸性体系下 HPLC 分析色谱图比较
峰形及载样量比较
在酸性体系下，在碱性药物阿米替林的杂质分析时，采用 CS-C18 与传统封端的 C18 柱进行比较，CS-C18 柱对碱性组分具有更好的峰形、载样量和分离度。
图 5. 不同色谱柱对阿米替林及杂质（0.25%）不同进样量分析结果比较
酸性体系下 LC/MS 灵敏度比较
在甲酸体系下，在进行液质联用分析时，CS-C18 柱提供可更好的灵敏度、响应和峰形。
图 6. 甲酸体系中低浓度标样（50ng/ml） 在 LC/MS/MS 中灵敏度比较
参考文献
1. L. R. SNYDER , J. J.KIRKLAND, J. W. DOLAN. Introduction to Modern Liquid Chromatography, ThirdEdition.
安捷伦网络讲座-方法开发与 C18 固定相的选择
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