Access Agilent 电子期刊（2015 年 5 月）
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技巧：利用 Agilent AdvanceBio 工作流程解决方案优化糖谱分析
作者：Andrew Coffey
安捷伦应用化学家
单克隆抗体 (mAb) 在生物治疗药物市场中占有主导地位，其包括设计用于治疗癌症或免疫疾病（例如克隆氏症、风湿性关节炎和哮喘）的多种产品。除此之外，还有数百种化合物处于临床试验阶段。但是，大多数经认证的 mAb 都是人源或人源化的。它们由哺乳动物的细胞培养物制备，通过生物工程手段构建与人源变体相同的蛋白质序列。一旦表达，这些抗体就会发生糖基化翻译后修饰。 Agilent AdvanceBio 糖谱分析工作流程提供了一种节省时间的优化方法，用于生成这类重要生物治疗药物的糖基化谱图。
糖基化过程中与蛋白质结合的多糖的结构尤为重要，因为它们会影响蛋白质的生物学活性。免疫反应依赖于抗体的 Fc（可结晶片段）区域与免疫细胞表面受体的相互作用。此外，该区域还可能与抗体依赖性细胞毒性作用 (ADCC) 或补体依赖性细胞毒性作用 (CDC) 中涉及的其他分子发生相互作用，多糖的实际结构则会影响相互作用的程度。
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图 1. 治疗性单克隆抗体中常见的 N-糖链。采用安捷伦解决方案可轻松监控这些不同结构的产生。
仅采用单一供应商解决方案即可高效获取糖基化谱图
对于通过生物工程手段构建的治疗性 mAb，多糖通常与抗体保守 Fc 区域的天冬酰胺 Asn297 残基连接。 最初与蛋白质连接的多糖经过酶的修饰之后可产生各种不同的结构（图 1）。因此，在开发和后续的生产过程中获取可控的糖谱仍然具有很大的挑战性。您必须持续地监控整个生产过程中的糖基化。
不同多糖的结构鉴定通常依赖质谱技术，而使用 HPLC，您可以同时实现定性和定量分析。
Agilent AdvanceBio 糖谱分析工作流程提供完整的解决方案，可实现：
- N-糖链断裂
- 多糖标记
- HILIC（亲水相互作用液相色谱）分离
- 采用参考标准品进行方法优化
该工作流程让您仅采用单一供应商解决方案，就能通过高效、稳定且可重现的方法获得糖基化谱图。
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图 2. 安捷伦为加速典型的糖谱分析工作流程提供了一套完整的解决方案。
糖谱分析（图 2）的理想方法是 HILIC 分离。首先我们必须使用 PNGase-F 酶将 N-糖链从蛋白质上裂解出来。将蛋白质在 37 °C 下温育 3 h 可获得裂解片段。接下来采用固相萃取 (SPE) 纯化裂解液，从中得到 N-糖链。为了提高灵敏度并消除裂解糖链的正位异构化作用，还需采用行业标准的 2-氨基苯甲酰胺 (2-AB) 对其进行标记。标记反应需在 65 °C 下进行 3 h。接下来采用 SPE 小柱纯化 2-AB 标记的多糖。
先进的糖谱分析色谱柱
安捷伦提供两种类型的 HILIC 糖谱分析色谱柱：1.8 µm 全多孔和 2.7 µm 表面多孔色谱柱。HILIC 的分离原理为将样品分配到颗粒表面的高水相环境中。1.8 µm 填料专为 UHPLC 应用设计，需要使用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱。2.7 µm 填料色谱柱规格更加多样，适用于 Agilent 1260 Infinity 液相色谱以及耐压 400 bar 的旧仪器。如果样品中 2-AB 标记多糖的含量较低，且进样体积较小，则需要使用高灵敏度的荧光检测。
所有 HILIC 的流动相运行顺序均为从高有机相到低有机相。有机相通常为乙腈，而且非常重要的一点是需要使用高纯度（HPLC 级别）的新鲜试剂。水相则用于形成强洗脱液，通常，该流动相为 pH 4.5 的 100 mM 甲酸铵。（该流动相可兼容质谱，因此您可将它与安捷伦四极杆飞行时间质谱配合使用）。一般采用 2.1 × 150 mm 的色谱柱，所以您必须优化仪器配置，尽可能减小死体积。同样的，您还需要注意，窄径 HILIC 色谱柱很容易过载。常用的进样体积仅为 1 µL，较大的进样体积会导致峰形变差和分离度降低。
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图 3. Agilent AdvanceBio 糖谱分析 2.7 µm，2.1 × 150 mm 色谱柱可实现 2-AB 标记 N-糖链的快速、高分离度分离。
优化的方法为珍贵样品提供保障
安捷伦葡聚糖分子量标准品和 IgG N-糖链谱库标准品可帮助您在分析珍贵样品之前对样品前处理和色谱柱操作条件进行优化（图 3）。您可以通过葡聚糖分子量标准品的保留时间来确定样品峰的相对“葡萄糖单元”（GU 值）。然后您可在在线数据库中进行搜索，以确定这些 GU 值可能对应的多糖结构。
高流速（2.1 mm 内径的色谱柱上 0.5 mL/min）较为常用，但这可能导致高背压。提高操作温度（40、50 或 60 °C）可降低洗脱液粘度，从而降低背压和改善峰形，但您需要谨慎改变操作温度，因为温度变化会导致某些 2-AB 标记 N-糖链的选择性发生改变。
基本上，如果您需要提高样品通量，可通过选择色谱柱实现更快的分离速度，而如果您需要使关键 N-糖链对的分辨率和分离度达到最高，可延长分析时间和使用更为平缓的梯度。
适用于生物制剂和生物仿制药的高效解决方案
生物治疗药物在改善人类健康方面有巨大的潜力。已批准的蛋白质和抗体治疗药物数目持续增长，这是因为这种重要的治疗药物类型专注于无药可用的情形。从疾病研究到 QA/QC 和生产过程的每个阶段，安捷伦都能够帮助您做出正确的选择，从而将治疗药物成功地推向市场。
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