Access Agilent 电子期刊，2016 年 3 月

用于手性药物代谢物可重现分离的多中心切割 2D-LC/MS 方法

Siji Joseph，安捷伦应用科学家

由于复杂生物基质中药物代谢物的丰度很低，因此要对其进行分析具有一定的挑战性。此外，目标代谢物通常为同量异位素并具有相似的碎裂模式，因此利用传统 LC/MS 分析通常难以获得明确的鉴定结果。手性药物及其代谢物带来了额外的挑战。针对药物代谢和药代动力学 (DMPK) 研究与法规要求，获得代谢物的手性分离并且建立可重现的监测方法则十分重要。采用多中心切割技术的 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案能够在这种严苛的环境下提供优异的结果。

棘手的分离问题

华法林 — 一种广泛应用的外消旋抗凝血剂，主要通过氧化代谢产生 4’-、6-、7-、8- 和 10-羟基代谢物。由于这些羟基代谢物为同量异位素并具有相似的碎裂模式，因此完全分离的色谱峰对于利用质谱可靠地测量痕量代谢物非常重要。

安捷伦出版物 5991-5725EN 之前介绍了采用超临界流体色谱 (SFC) 与三重四极杆 (QQQ) 质谱联用对华法林及羟基代谢物进行同步鉴定和定量分析。本文介绍了采用多中心切割二维液相色谱/飞行时间质谱 (Q-TOF) 方法对华法林及五种主要羟基代谢物进行成功的非手性和手性分离。

多中心切割能够分离所有的峰

本研究采用 Agilent 1290 Infinity II 二维液相色谱解决方案与 Agilent 6530 精确质量四极杆飞行时间 (Q-TOF) 液质联用系统相结合。该 2D LC/MS 方法在液相色谱第一维采用非手性反相分离（苯基己基固定相），然后通过多中心切割将华法林及羟基华法林代谢物转移至第二维手性柱（Chiral OD-3R 和/或 Chiral AD-3R）。该方法能够在进行高分辨率精确质量 MS 和 MS/MS 分析之前分离该手性药物及其代谢物。

图 1. 用于精确中心切割应用的 2 位/4 通双阀的示意图

图 2. UV 数据表明利用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl Hexyl 色谱柱可实现出色的第一维非手性分离

图 3. 在第二维使用 ChiralPak 色谱柱实现羟基华法林的外消旋对以及母体 R/S-华法林的立体选择性分离

图 4. 6 位/14 通阀与一组 6 个预安装的进样定量环简化了六个中心切割馏分的存储

图 5. 智能阀-定量环设置能够保存 12 个中心切割的流出物。其结合了 2 位/4 通双阀（示于中心）以及两个 6 位/14 通阀

利用二极管阵列检测器 (DAD) 记录液相色谱第一维之后的 UV 信号并确定中心切割时间。使用 2 位/4 通双阀进行多中心切割（图 1）。当阀处于位置 1 时，第一维色谱柱流出物进入 DAD，然后流至废液瓶。当阀处于位置 2 时，进行中心切割。第一维色谱柱流出物进入 80 µL 定量环中。根据所需分析物的峰宽，在预先确定的持续时间 0.6 min 内填充该定量环。采用类似的策略对其他峰进行中心切割。安捷伦 LC/MS ChemStation 软件（C01.03，带有 2D-LC 插件）能够轻松、精确地控制二维液相色谱中心切割。

药物代谢物的立体选择性分离

Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl Hexyl 反相柱使华法林和所有五种羟基代谢物获得了优异的基线分离，分离度高于 4（图 2）。

在第二维使用 ChiralPak OD-3R 色谱柱能够使羟基华法林的五种位置异构体中四种的对映体对获得基线分离，但无法分离 10-羟基华法林对映体（图 3A）。使用 ChiralPak AD-3R 色谱柱能够分离羟基华法林的五种位置异构体中四种的对映体对（包括 10-羟基华法林），但无法分离 7-羟基华法林对映体（图 3B）。然而，在液相色谱第二维中将 ChiralPak OD-3R 和 AD-3R 色谱柱串联能够分离所有五种羟基华法林位置异构体的对映体以及华法林母体，在 25 分钟内共得到 12 个色谱峰（图 3C）。Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统的高耐受压力支持将两根填充有不同色谱柱固定相的色谱柱联用，并且实现代谢物对映体的出色分离。

硬件的改进能够提供成功的多中心切割分析

借助新型改进的安捷伦多中心切割阀套件，更容易进行多中心切割。一个 6 通/14 位阀包含在该多中心切割二维液相色谱升级工具包 (G4242A) 中，并且可连接至 2 位/4 通双阀 (5067-4170)。该 6 通/14 位阀具有一组六个预先安装的进样定量环，并且可轻松储存来自第一维色谱柱的六种中心切割流出物（图 4）。

如果您需要更多次中心切割，该双阀可与两个 2 位/4 通双阀联用。该阀配置能够提供具有 12 个定量环位置的两个峰驻留组件（图 5）。新的软件“多中心切割查看器”使您能够轻松执行并监控多中心切割实验。