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Agilent Bio-Monolith Protein A 和 G 色谱柱为 mAb 效价测定提供更多选择

作者：Phu T. Duong 和 Linda L. Lloyd
安捷伦生物色谱柱部门

近年来，随着对多种疾病治疗需求的不断增长，单克隆抗体 (mAb) 作为一类最主要的生物制药产品受到了越来越多的关注。这些抗体经设计，代表着特定的基因组成，可更好地靶向病原体。在这类抗体的开发过程中，Protein A 和 G 分析亲和柱可用于测定多种细胞培养基上清液中这些抗体的效价或浓度，以筛选最高产量的克隆。

因为 Protein A 和 G 色谱柱对抗体有高度亲和性，所以它们只和细胞培养基上清液中的抗体相结合。但是，它们有不同的选择性。例如，Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱对人亚类 IgG1 和 IgG2 有高亲和性，但对 IgG3 无亲和性，而 Agilent Bio-Monolith Protein G 色谱柱对人亚类 IgG1、IgG2 和 IgG3 均有高度亲和性。相反地，Protein G 色谱柱对人亚类单克隆抗体例如 IgA 和 IgD 无亲和性，但 Protein A 色谱柱可与这些抗体相结合（表 1）。总的来说，这些色谱柱功能相互补充，可用于现有生物治疗药物开发过程中多种 mAb 亚类和片段的效价测定。

表 1. Protein A 和 G 与不同人类及小鼠 IgG 亚类的结合亲和性 [1,2]

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图 1. 比较 Agilent Bio-Monolith Protein A 和 G 色谱柱捕获 IgG3 的选择性

选择正确的色谱柱用于高特异性高选择性地捕获细胞培养基上清液中的特定 mAb

在接下来的例子中，我们分析了 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱和 Bio-Monolith Protein G 色谱柱对人类单克隆抗体的互补特性。图 1 阐释了这些色谱柱对 mAb 的特异性。当在含有宿主细胞（CHO 细胞）蛋白的上清液中加入 IgG3 mAb，并上样至 Agilent Bio-Monolith Protein G 色谱柱（如右图所示），只有 IgG3 可被捕获。在 1.0 mL/min 流速下，它可在 1.6 分钟左右洗脱，而宿主细胞蛋白无法被色谱柱捕获，洗脱得到一个流穿峰。Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱（如左图所示）无法捕获 IgG3 样品。如表 1 中所示，这两种色谱柱对抗体有着不同的选择性。图 1 展示了这两种色谱柱的不同选择性。两种色谱柱均可结合并分离 IgG1 和 IgG2（数据未展示），但是只有 Bio-Monolith Protein G 可捕获上清液中的 IgG3。

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图 2. A，色谱峰面积线性；B，原位清洗前后，色谱柱可恢复其全部容量及性能

采用安捷伦色谱柱可实现准确定量和良好线性

准确定量单克隆抗体的效价在细胞系选定后的开发早期十分必要，并且在生产过程中也很重要，这是因为细胞培养基上清液中 mAb 的含量决定了最佳的采集时间。为了证实 Agilent Bio-Monolith Protein A 和 G 色谱柱在 mAb 准确定量中的作用，分别在色谱柱中上样不同量 (µg) 的纯化后 IgG。用色谱峰和 IgG 含量数据作图构建线性曲线，以确定分析的准确性。图 2A 展示了 Protein G 色谱柱中峰面积的线性。色谱峰面积的线性说明了 Agilent Bio-Monolith Protein G 色谱柱可用于采集细胞培养基中不同浓度范围 mAb 的准确定量。色谱柱上样量低至 10 µg。10 µg 上样条件下，信噪比 (S/N) 不高于 1:1（数据未展示）。Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱可获得类似数据（除了 IgG3 数据之外）（数据未展示）。两种色谱柱的最大上样量约为 400 到 500 µg IgG，这涵盖了细胞系筛选及生产过程中的浓度范围。由于它们具有特殊设计的聚合物基质，Agilent Bio-Monolith Protein A 和 G 色谱柱十分坚固耐用。通过原位清洗可轻松恢复它们的性能（图 2B）。

宽范围 mAb 异构体的快速效价测定

Agilent Bio-Monolith 蛋白 A 和 G 色谱柱具有互补性，因此 Protein G 对那些无法与 Protein A 结合的 mAb 有亲和性，反之亦然。这些色谱柱为宽范围 mAb 异构体的快速效价测定提供了更多的选择。由于校正曲线的线性范围很宽，因此可在较宽的浓度范围内测定效价以实现候选物浓度的准确定量。

安捷伦色谱柱可加快生物分子表征并提高表征准确性

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参考文献

1. Richman, D. D., Cleveland, P. H., Oxman, M. N. and Johnson, K. M. 1982. “The binding of 1.
   Staphylococci protein A by the sera of different animal species.” J. Immunol. 128: 2300-2305.
2. Frank, M. B. 1997. “Antibody Binding to Protein A and Protein G beads”. 5. In: Frank, M. B., ed. Molecular Biology Protocols. Oklahoma City.

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