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咨询专家：什么是用于糖基化表征的最好系统？

作者：Linda Lloyd
安捷伦生物色谱柱产品经理

安捷伦很荣幸为大家介绍由我们的学科专家撰写的一系列信息丰富的全新文章，可为生物分子表征提供优化液相色谱系统配置的答案和有益的建议。我们还将为您提供通用方法的相关入门指导以及如何就满足特定分离需求而进一步优化方法的相关指导。在这第一篇文章中，我们的专家重点讨论了多聚糖分析，其中采用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱以及 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱。

问题：我想要获得高分离度及更小的背压，该使用何种色谱柱？

答： 装填 2.7 µm 表面多孔填料的 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱，可满足这些应用的要求。推荐流动相 A 为 100 mM 甲酸铵，pH 4.5，B 为乙腈（质谱兼容）。流速 0.5 mL/min 可实现高分离度分离。如要进行高速分离，流速可增大至 1.0 mL/min。但是，高水相清洗时需注意应一直保持较低的流速。表 1 和表 2 分别列出了高分离度和高速分析所推荐的梯度。

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图 1. 安捷伦 2-AB 标记的葡聚糖分子量标准品及 2-AB 标记的人类 IgG N-糖链文库的高分离度分离

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图 2. 采用 1.8 µm 粒径的 Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱以及初步谱峰归属对 2-AB 标记的 N-糖链进行高速分离

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图 3. 采用 1.8 µm Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱及甲酸铵或乙酸铵流动相进行牛胎球蛋白多聚糖分析

为了最大程度提高分离度，我们采用 1 到 2 µL 的进样量。样品应首先用水溶解，然后配制成 70:30 乙腈:水溶液。我们还建议使用冷却装置改变柱温箱的温度。例如，40 °C 可延长色谱柱寿命，而 60 °C 下色谱峰更为尖锐，但会缩短色谱柱寿命。选择性和分离度也可能会随温度变化而变化。在本次分析中，Agilent 1260 Inifinity 荧光检测器采用 260 nm 激发光，430 nm 发射光，以及 8 µL 流通池。图 1 展示了高分离度分离的实例。

欲进一步了解本次分析的详情，请参阅免费提供的安捷伦出版物 5991-6110CHCN。

问题：选用何种色谱柱可进行快速分离并获得最大分离度？

回答：这种情况下可选用 1.8 µm 粒径的 AdvanceBio 糖谱分析色谱柱，并采用 Agilent 1290 Infinity II 系统进行分析。流动相、温度条件、进样量，以及流速与高分离度分离的条件相同。较小的色谱柱尺寸 (2.1 x 150 mm) 仍需较小的进样量。荧光检测器和参数也相同。建议的初始梯度与 2.7 µm 色谱柱相同。但是，虽然两个梯度的斜率均为 1.25%/mL，您可能还需要调整梯度的起点和终点才可使含有不同类型多聚糖的样品获得最大的分离度。例如，较大的多聚糖结构可能需要采用 75% - 55% 的乙腈梯度以获得最佳结果。

图 2 展示了 2-AB 标记的 N-糖链的高速分离。

问题：多聚糖分析的最佳流动相是什么？

回答：在多聚糖分析中，控制 pH 非常重要，因此通常会使用缓冲液。而为了与质谱兼容，这会限制流动相只能选择所需 pH 的甲酸或乙酸盐。多聚糖（例如牛胎球蛋白中的）可由甲酸铵或乙酸铵流动相洗脱，如图 3 所示。

欲了解本次分析的全部详情，请参阅免费提供的安捷伦出版物 5991-6183CHCN。

在下个月的文章中，我们将会讨论体积排阻色谱柱用于生物分子分析。我们的专家将会回答该主题中的常见问题，并就您实验室的工作提供一些实用建议。同时，了解安捷伦生物色谱柱系列更多的应用。

用于生物制药的先进安捷伦解决方案

安捷伦提供高分离度色谱柱、样品前处理方法和标记的及未标记的标准品，帮助您深入了解生物仿制药。这些先进的方法有助于您正确测定分子量以及进行鉴定，并发现难分离的杂质。了解安捷伦生物制药解决方案如何帮助您推动生物制药研究进展。

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