Access Agilent 电子期刊（2015 年 5 月）
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Agilent microRNA 分析方法用于检测运动员血液中的兴奋剂
作者：Francesco Donati
FMSI 反兴奋剂实验室，罗马
以及 Bernhard Wuest
《运动兴奋剂》/《运动医学》全球营销经理
在体育比赛中，一些运动员会通过不道德的手段取得优势，以提高自己的成绩，例如通过输血来增加体内的氧气输送速率。世界反运动禁药机构禁止运动员进行违规增血。
违规增血有两种不同的类型。自体输血采用自身的血液，而异体输血采用其他供体的血液。在反兴奋剂实验室中，现在已有方法可检测异体输血，但是暂无国际公认的方法可用于直接检测自体输血。目前，自体输血只能通过对关键血液学参数的靶标纵向分析进行间接检测。在本文中，我们考察了一些针对这一挑战的不同的方法。
将 MicroRNA 作为输血的生物标志物
我们研究了将 microRNA (miRNA) 作为生物标志物检测自体血回输时的作用和变化性。miRNA 为非编码 RNA，含有 18 至 24 个核苷酸，是哺乳动物基因表达的转录后调节因子。它们首先由一个编码基因在细胞核内生成初级 miRNA，然后被运送至细胞质内，通过 Dicer 酶剪切形成前体 miRNA ，最后由 RISC（RNA 诱导沉默复合体 ）加工形成功能成熟的 miRNA。由于成熟的 miRNA 可影响目标信使 RNA (mRNA) 的剪切，可作为转录抑制剂，还能参与 mRNA 的脱腺苷化，因此它们可参与调节多个生理过程（例如红细胞生成） 。
我们采集了健康运动员的六个全血样品，在三个不同时间点（T=0，样品采集后的 24 小时内；T=1，样品采集 15 天之后；T=2，样品采集 30 天之后）对样品进行提取，并定量分析了其中的 mi923、mi150、mi144、mi96、mi196a、mi30b、mi197、mi451。同时我们还采集了一个供体的新鲜血液样品，并以浓缩红细胞的方式储存，30 天之后与同一供体的新鲜血液混合，用以模拟离体自体输血。所有的 miRNA 均采用专用的试剂盒进行提取，并采用 Agilent 2100 生物分析仪芯片电泳系统进行定量。接下来将 5 ng miRNA 样品逆转录为 cDNA，用作定量 PCR (qPCR) 的模板。miRNA 的表达以相对定量 (RQ) 结果 2-ΔΔCt 来表示（通过按照校正样品的 ΔCt （计数）对 ΔCt 进行标准化得到 ΔΔCt 值）。
检测 miRNA 随时间的变化
我们的法医学测试结果如图 1 所示。通过上方的一排图片，您可以观察到 miRNA 的变化。T=0 时，mi923 和 mi451 的 RQ 表现出最为一致的变化，而 mi30b、mi196a、mi197 和 mi196 变化最小。下方的图片则展示了 miRNA 在超过 30 天的储存中的纵向变化。
与 T=0 相比，T=2 时，miRNA 在样品中的表达量有逐渐增加的趋势。mi197、mi96、mi30b 和 mi451 的变化均在 2-4 个数量级范围内。虽然样品间的差异很大，mi144 和 mi923 从 T=0 到 T=2 的表达量变化最为一致。
提供自体输血的证据
我们在浓缩红细胞样品 (T=30) 中观察到了一个明显的差异，与 T=0 的新鲜样品相比，其 mi923、mi30b、mi197、mi96 和 mi451 的表达水平均明显增高。有趣的是，一些 miRNA 的表达非常高，在离体输血样品中仍可检测到高于新鲜未输血样品的表达量。此外，与新鲜样品相比，在输血样品中 mi144 和 mi923 的表达量增加最为明显。因此，miRNA 表达可用作血液储存的生物标志物以及血液回输检测的生物标志物（图 2）。
采用 miRNA 表达量作为违规增血检测的证据看上去很有发展前景。该技术具备此类应用所需的灵敏度和重现性。但是，未来研究工作的关键目标之一是考察诊断性 miRNA 表达在个体内的差异。我们研究团队的下一步工作包括拓展所分析的 miRNA 范围，并进行实际的群体研究，对表达差异进行统计学及法医学分析。如需了解该研究的详细内容，请参阅安捷伦出版物 5991-5717EN。
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