Access Agilent 电子期刊，2015 年 3 月

采用配备新型荧光检测器的毛细管电泳对药用蛋白质进行经济高效的表征

作者：Audrey Boutonnet
Picometrics 实验室应用专家

及 Christian Wenz
安捷伦研发科学家

单克隆抗体作为治疗药物，可用于控制癌症、过敏症、炎症、及传染和自免疫疾病。毛细管电泳 (CE) 及激光诱导荧光 (LIF) 检测常用于这些治疗性蛋白分析的质量控制。最近研究发现，发光二极管 (LED) 可用作荧光检测中的光源，价值极高。与激光相比，LED 价格更低、所需能量更少且更为稳定。

本文描述了毛细管电泳-发光二极管诱导荧光 (CE-LEDIF) 方法在两个相关分析中的应用。其中一个是重组单克隆抗体 (rMAb) 的纯度分析，另一个是治疗性蛋白的多糖表征。

合作获得有力工具

安捷伦与 Picometrics 科技公司签订了持续营销协议，为生物制药客户提供 CE-LIF 检测与质谱 (MS) 的联用解决方案。除采用经典 CE-LIF 分析技术以外，此套工具还提供了当今唯一一款在线 CE-LIF-MS 解决方案。该平台非常适合复杂大分子生物制药化合物（例如 rMAb）的研发。

对于 rMAb 纯度分析及多糖表征，我们主要使用以下安捷伦/Picometrics 仪器：

Agilent 7100 毛细管电泳系统
Picometrics Zetalif LED 450 或 480 nm
Agilent OpenLab 软件，配有 LIF 驱动程序

荧光检测池可集成到 Agilent 7100 CE 匣中，或直接放置于质谱雾化室之前，接收 CE 仪器给出的信号（如本例多糖分析中的 CE-LIF-MS 检测）。配有 LIF 驱动程序的 OpenLab 软件可同时控制 CE 和 LEDIF 检测器。

分析实验 1：治疗性蛋白的质量控制

对于质量控制，利用 3-(2-呋喃甲酰)-喹啉-2-甲醛 (FQ) 对 rMAb 进行衍生化，该试剂与伯胺反应产生的衍生物具有荧光。衍生化过程十分迅速，且不需要额外的纯化以去除未反应的试剂。

我们在 rMAb 样品中加入不同浓度的 12 kDa 大小的蛋白标准品（霍乱毒素 B，CTB）：0.05%、0.10%、0.15%、0.20% 和 0.25%。480 nm LED 的分析结果如图 1 所示，说明检测限 (LOD) < 0.05% CTB。该数值与已报道的 LOD 相近，且后者采用的是更为昂贵的激光系统。

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图 1. 加入五个不同浓度 CTB 污染物时 rMAb 的 CE-LEDIF 纯度分析。杂质的定量分析具有良好的准确性和精确度。插图为放大 100 倍后的结果

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图 2. 为了准确比较信号，在线 CE-LEDIF-MS 系统显示 LEDIF 检测器与电喷雾离子源之间距离非常短 (5 cm)

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图 3. APTS 标记的 rMAb N-糖链的在线 CE-LEDIF-MS 分析可结合 LIF 及 MS 检测器的结果

分析实验 2：利用在线 CE-LEDIF-MS 进行单克隆抗体的多糖表征

由于糖类会影响蛋白的稳定性及作用机理，因此表征治疗性蛋白的糖类结构十分重要。CE-MS 技术结合在线 LEDIF 检测是检测主要及次要多糖峰的可选方法。图 2 展示了我们在近期研究中所使用仪器的示意图。在该方法中，毛细管入口放置于入口缓冲液中，而毛细管出口伸出仪器之外，放置于电喷雾质谱离子源内。对于在线 LEDIF，检测池置于电喷雾尖端的上游，并由一个可调手臂固定。

我们的分析采用 PNGaseF 进行多糖的酶裂解，然后采用 APTS（1-氨基芘-3,6,8-三磺酸）对多糖进行标记。接着对 APTS-多糖进行纯化并利用 CE-LEDIF-MS 进行分析。图 3 显示 G0、G1、G1′ 和 G2 等主要种类很容易被鉴定。因此，我们可在一个分析中同时获得 LIF 及离子强度信号，可对两个结果进行准确比较。