Access Agilent 电子期刊，2015 年 3 月

用于生物治疗药物分析的有效方法

作者：Sonja Schneider、Xiaomi Xu 和 Phu Duong
安捷伦应用科学家

在生产和纯化期间，由于氨基酸取代、糖基化、磷酸化，以及其它翻译后或化学修饰作用，生物治疗性抗体会在电荷异质性上出现变化。蛋白质分析中，在给定 pH 下发生电荷变异，说明其分子一级结构出现变化，从而导致其它蛋白质构象产生。这些变化会影响药物的稳定性和活性，或者引起免疫不良反应。电荷异构体的分析是生物药物开发中的关键因素。本文中，我们的专家团队介绍了一些检测方法，以加深您对生物治疗药物分析的理解。

糖基化分析的重要性

重组治疗性糖蛋白的糖基化谱图是一个重要参数，它会影响糖蛋白的安全性、有效性和一致性。除了采用 HILIC 进行糖基化模式分析外，还可利用阴离子交换色谱评估糖链电荷谱图。N-糖链的电荷谱图展现了包含不同数目阴离子糖类的 N-糖链的分布，它可能包括中性、单-、双-、三-、四-，以及更高带电数目的糖链结构。糖链带电通常是因为含有唾液酸，或者由于糖链结构中单糖单元的磷酸化或硫酸化，但这比较少见。

哺乳动物细胞表达的蛋白质上连接的 N-糖链有两种类型的唾液酸残基，即 N-乙酰-神经氨酸 (NeuAc) 和 N-羟乙酰神经氨酸 (NeuGc)。这些结构通常连接到 N- 和 O-连接糖链非还原端的半乳糖残基上。在人类蛋白质中，正常唾液酸化作用利用的是 NeuAc，而 NeuGc 出现在非人类哺乳动物蛋白质中，不能用做治疗性糖蛋白。糖链电荷谱图是用于监控生物治疗性蛋白的一个重要参数，是 HILIC 分析的重要补充，可以加深我们对唾液酸化作用的理解，并识别潜在不良唾液酸残基是否存在。

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图 1. 牛胎球蛋白的电荷谱图。图中结构是不同电荷/唾液酸化 N-糖链的一些实例，通常出现在胎球蛋白中

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图 2. 使用 Agilent Bio MAb 5 µm 色谱柱和 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱分离完整和羧基端酶解的 IgG1

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图 3. 羧基端酶解 IgG1 的组成

在我们的第一个实例中，胎球蛋白的 N-糖链被酶切，随后采用 2-氨基苯甲酰胺进行标记，然后再采用 HILIC 小柱进行净化。糖链电荷谱图的测定采用 Agilent Bio SAX 色谱柱和 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱。图 1 展示了牛胎球蛋白的电荷谱图，分离了中性（峰 1）、单-（峰 2）、双-（峰 3）、三-（峰 4）、四-（峰 5），以及五-唾液酸化（峰 6）的 N-糖链。紧邻峰的结构表示了分别带有 0-5 个唾液酸的不同电荷的糖链，这通常出现在牛胎球蛋白中。色谱峰得到很好的分离，并且分析具有优异的精密度，保留时间和峰面积精度的相对标准偏差分别小于 0.002% 和 10%。如需了解更多有关该分析的信息，可查看免费安捷伦出版物 5991-5221EN。

采用安捷伦色谱柱进行高分辨 IgG1 分析

单克隆抗体/IgG1 (mAb) 是一种生物治疗药物，在过去 10 年间得到广泛应用。然而由于其结构较为复杂，IgG1 常常表现出高度的异质性，这种异质性包含了各种各样的翻译后修饰。其中，常见的是重链上羧基端不同水平的赖氨酸修饰。羧基端赖氨酸变体异质性的程度能够反映生产的一致性，因此有必要对其进行评估。阴离子交换 Agilent Bio MAb 5 µm 色谱柱提供了实现高分辨 IgG1 分析所需要的选择性，尤其是用于 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱中时。

在本研究中，我们使用羧肽酶 B 从 IgG1 的羧基端来裂解碱性氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。通过比较完整和羧基端酶解 IgG1 的色谱图，可以鉴定出 IgG1 羧基端赖氨酸的连接情况。图 2 展示了完整和羧基端酶解 IgG1 的叠加色谱图。上面是完整的色谱图，下面是局部放大图。大约在 2 min 时最先流出羧肽酶 B。有 4 个来自原始 IgG1 的碱性变体峰，以及来自 lys-1 和 lys-2 赖氨酸变体的两个峰。这些变体的峰面积分别约占总峰面积的 8.64% 和 1.34%（图 3）。连续进样 10 次 IgG1，检测分析的重现性。结果表明，保留时间、峰形和峰面积都高度一致。查看安捷伦应用简报 5991-0895CHCN，以获取本研究工作的完整信息。