Access Agilent 电子期刊（2015 年 6 月）

Agilent UHPLC 可对复杂蛋白质组学样品进行高通量、稳定、可重现的液质联用分析

作者：Christine Miller 和 Mike Hagmaier
安捷伦组学领域营销团队

当样品量有限时，蛋白质组学研究通常使用纳喷雾液质联用来实现最大的灵敏度。由于电喷雾离子化 (ESI) 会产生较高的离子化效率并且具有浓度依赖性，因此使用较小内径 (id) 的色谱柱和较低的流速可提供最佳的灵敏度。然而，使用和维护纳流液质联用系统需要更多技巧。此外，有限的纳流柱容量会导致获得不太可靠的色谱。

超高效液相色谱 (UHPLC) 色谱柱的较大内径可提高样品载量，但灵敏度通常是蛋白质组学分析的限制因素。现在，这种状况已经改变。结合了 iFunnel 技术的安捷伦高性能质谱仪通过标准流路液质联用系统，对复杂基质中的多肽进行了分析，并且获得了前所未有的灵敏度。

iFunnel 技术提高了灵敏度

Agilent iFunnel 技术将安捷伦喷射流技术高效的电喷雾离子生成和离子聚焦性能与六孔毛细管采样阵列完美结合，从而使 ESI 喷雾羽流中有更多的离子进入质谱仪离子光学透镜。[1] 独有的双级离子漏斗可增加离子传输，并大大提高信噪比。安捷伦喷射流热梯度聚焦技术可通过提高离子脱溶和空间聚焦显著提高灵敏度。 [2] 超热鞘气（氮气）可限制雾化器喷雾，有效地干燥离子并使它们集中在热约束区。通常来说，可以使质谱和串联质谱的灵敏度提高 5 到 10 倍。

放大图片

图 1. 上样量为 1 fmol LVNEVTEFAK 时的微板流路液质联用（蓝色）与标准流路液质联用（黑色）。安捷伦喷射流离子源可接受较稳定的 2.1 mm 色谱柱的更大流量

放大图片

图 2. 将合成多肽标准品加入到烯醇化酶胰蛋白酶酶解物中，采用 Agilent 6495 QQQ 和超高效液相色谱进行分析，并且获得了出色的灵敏度。在定量下限 (LLOQ)，重现性为 14％ (n = 10)，准确度为 109.8％

放大图片

图 3. 技术重复样本间具有良好的重现性

采用喷射流时获得更佳的灵敏度

与 ESI 相比，安捷伦喷射流离子源在 15 µL/min 的微板流路流速下能使多肽的信号增强三倍以上。[3] 此外，喷射流技术显示出对质量敏感的响应（灵敏度正比于引入离子源的样品量），这样可在 2.1 mm 内径的色谱柱上进行更强大的色谱分离，且不会降低灵敏度（图 1）。[4]

由于纳流液质联用系统具有较高的离子化效率，并且纳流喷雾被喷洒到质谱入口附近，因此该系统可提供约 1/10 的更低检测水平，但您只需通过注入更多的样品便可降低这种灵敏度差异。人血浆的试验表明 [5]，在配备有喷射流离子源的标准流路液质联用系统中注入 10 倍以上的血浆，能使 81 种目标多肽中的 72 种获得相同或更好的灵敏度。

三重四极杆质谱上的定量蛋白质组学

对于复杂生物基质，采用标准流路液质联用系统获得的改进的色谱性能使整体分析得到显著改善。[6] 通过喷射流离子源连接到 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统的安捷伦三重四极杆质谱仪可提供高灵敏度、可靠性以及出色的保留时间的稳定性。有了具备 iFunnel 技术的 Agilent 6495 三重四极杆液质联用系统和安捷伦喷射流离子源，您可以获得埃摩尔级的多肽检测限 (LOD)，从而实现常规的高灵敏度的多肽定量分析（图 2）。

在 Q-TOF 上发现蛋白质组学

有了安捷伦喷射流技术和 Agilent 6550 iFunnel Q-TOF 液质联用系统，当样品量没有限制时，就可以使用超高效液相色谱发现蛋白质组学。[7] 人们已将这种高通量的 UHPLC/MS 分析应用到一组使用 30 分钟梯度的四种不同人胶质母细胞瘤 (GBM) 的细胞系中。在错误发现率 (FDR) 为 1％的初步分析中，鉴定出了 4264 种独特的人蛋白和 24916 种独特的多肽。技术重复样本间的重现性 (n=3) 表明，有 94％的蛋白质在三个重复样本中的至少两个中被鉴定出，有 64％的蛋白质在所有的重复样本中被鉴定出（图 3）。

加强蛋白质组学研究

安捷伦为发现和靶向蛋白质组学研究提供所有必需的工具。了解安捷伦蛋白质组学仪器和软件产品的完整产品线，请参阅蛋白质组学产品样本。

参考文献

Mordehai, A; Fjeldsted, J. “Agilent Jet Stream Thermal Gradient Focusing Technology” Agilent Technical Note 5990-3494EN, 2009.
Momoh, P; et al. “iFunnel Technology for Enhanced Sensitivity in Tandem LC/MS” Agilent Technical Overview 5990-5891EN, 2010.
Love, C; Miller, C. A; Mordehai, A. “Using Thermal Gradient Focusing ESI to Develop Sensitive, High-Throughput Capillary Flow LC/MS/MS Peptide Quantitation AssAss“ ASMS 2011.
Buckenmaier, S; Miller, CA; van de Goor, T; Dittmann, MM. (2015), "Instrument contributions to resolution and sensitivity in ultra highperformance liquid chromatography using small bore columns: Comparison of diode array and triple quadrupole mass spectrometry detection“ J Chromatogr. A, 1377:64-74.
Percy, A. J; et al. “Comparison of standard- and nano-flow liquid chromatography platforms for MRM-based quantitation of putative plasma biomarker proteins“ Anal. Bioanal. Chem. 2012, 404(4), pp 1089-1101.
Domanski, D; et al. “High-flow multiplexed MRM-based analysis of proteins in human plasma without depletion or enrichment“ Clin. Lab. Med. 2011, 31(3), pp 371-384.
Yang, Y; Bhat, V; Miller, C. “Jet Stream Proteomics for Sensitive and Robust Standard Flow LC/MS” Agilent Technical Overview 5991-5687EN, 2015.