Access Agilent 电子期刊（2015 年 6 月）
>> 更新资料 | 订阅 Access Agilent | 文章目录
咨询专家：如何利用反相液相色谱进行生物仿制药分析？
作者：Koen Sandra
比利时 Kortrijk 色谱研究所
和 Maureen Joseph
安捷伦生物制药应用
在上个月发表的生物仿制药的文章中，我们回答了关于用亲和色谱进行生物仿制药表征的首要步骤的问题。这项强大的技术最常用于重组蛋白纯化和克隆选择的第一阶段。本月，我们将重点关注反相液相色谱，使用该技术检测完整结构并获得肽谱，并且当该技术与质谱联用时，这种组合将提升结果的可信度。
问：什么是反相液相色谱？
答：反相液相色谱是一种用于表征单克隆抗体和生物仿制药的强大工具。该项技术在与紫外检测器联用时可进行 QC 监测和产品放行测试，并且在与质谱联用时可对多种样品进行表征，包括完整抗体和酶解抗体的肽片段。
放大图片
图 1. 反相液相色谱分析在单克隆抗体和生物仿制药表征方面的 4 个实例。
放大图片
图 2. 使用 Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 2.1 x 100 mm, 1.8 µm 色谱柱对完整赫赛汀原研药和生物仿制药进行反相液相色谱梯度分离。
放大图片
图 3. 使用 Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱 (2.1 x 100 mm, 2.7 µm) 对赫赛汀及其生物仿制药的胰酶裂解多肽进行反相液相色谱分离。
问：为什么要用反相液相色谱分析生物仿制药？
答：填充小粒径表面多孔填料的反相色谱柱在表征单克隆抗体和生物仿制药时，可提供出色的分离度并节省分析时间。图 1 显示了使用反相色谱分离赫赛汀的完整单克隆抗体、重链 (Hc)/轻链 (Lc)、抗原结合片段 (Fab/Fc) 以及胰酶裂解多肽的 4 个实例。在这些实例中，液相色谱和液质联用系统或与填充了亚 2 µm 全多孔填料的 UHPLC 柱配合使用，或与填充了 2.7 µm 表面多孔填料的 HPLC 柱配合使用。分离目的是进行鉴定并测定纯度，以便在最短的时间内对原研药和仿制药的治疗性进行表征和对比。请注意，完整的单克隆抗体、Fab/Fc 和 Lc/Hc 均可使用同一个色谱方法进行分离。
问：用反相液相色谱测定完整单克隆抗体的效果怎么样？
答：用典型的反相梯度分离完整单克隆抗体时，有机溶剂的微小变化都可影响分离效果。我们需要降低有机溶剂的总范围并使用平缓的梯度（低 %B 变化/min）。图 2 显示了赫赛汀原研药与生物仿制药的分离实例。我们使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 柱纯化生物仿制药，如上个月的文章中所述。由于 Agilent 1290 Infinity 液相色谱上配置的 Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 1.8 µm 色谱柱具有高分离度，因此紫外色谱图中可鉴定出数个色谱峰。
问：反相液相色谱能否帮助我了解微小修饰？
答：可以。当分离包括 Fab/Fc、 Lc/Hc 和多肽在内的单克隆抗体片段时，该方法可提供更多信息。图 3 显示了使用 Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱和Agilent 1290 Infinity 液相色谱仪对赫赛汀及其生物仿制药的胰酶裂解多肽进行的 RPLC-UV 分离。肽谱可以提供有关一级结构和翻译后修饰的大量详细信息，从而可对原研药和生物仿制药进行深度表征和比较。虽然图 3 中显示的肽谱具有高度一致性，但在糖基化方面还是存在差异。不同的糖基化变体得到了良好的色谱分离，并通过紫外检测器检出。生物仿制药的低半乳糖化非常明显。从肽谱数据中鉴定出的其他数个杂质包括赖氨酸截短、蛋氨酸氧化和天冬酰胺的脱酰胺基化。所有这些修饰都是轻微且少量的，但却对单克隆抗体的药效和安全性至关重要。
这些赫赛汀及其仿制药的反相液相色谱分析实例显示了单克隆抗体表征和比较的关键分离。在下一期 Access Agilent 中，我们将关注电荷异构体和聚集体分析，并在文章中推荐一款用于加快分析速度的强大软件工具。所有文章的详细内容都可在 Prepping Biosimilars 中免费获得。
安捷伦生物制药和液相色谱解决方案
通过采用使用了亚 2 µm 表面多孔色谱柱的高分离度、优化后的梯度液相色谱方法，并配合使用紫外检测器和精确质量数 Q-TOF，我们可帮助您深入了解生物仿制药。这些先进的方法将帮助您正确测定分子量、进行鉴定、确证纯度，并发现难分离的杂质。了解更多关于安捷伦生物制药解决方案的信息，以帮助您推动生物制药研究进展。
此外，安捷伦还提供多种液相色谱产品和解决方案，全球数万个实验室信赖安捷伦液相色谱系统，享受该系统时刻提供的高质量结果。已有超过一百万个液相色谱模块部署到全球各地的实验室中，并提供着无与伦比的性能、分析效率和可靠性。立即联系安捷伦客户中心，为您的应用找到正确的液相色谱解决方案。
>> 更新资料 | 订阅 Access Agilent | 文章目录
