Access Agilent 电子期刊（2015 年 7 月）

Agilent Poroshell HPH 柱能在高 pH 的氨基酸分析中进行简单的方法转换

作者：William Long
安捷伦液相色谱应用

高效液相色谱柱和仪器的持续改进，为改善高效液相色谱方法提供了契机。例如，针对在 HP 1090 系列高效液相色谱系统上开发的、分析邻苯二甲醛/芴甲基氯甲酸酯 (OPA/FMOC) 衍生氨基酸的方法，已经在 Agilent 1100 系列仪器上进行了升级。现在，我们利用 Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱和最近推出的表面多孔 Agilent Poroshell HPH-C18 色谱柱，使方法又有了新的改进，优化了高 pH 下的分析。

在 3.5 和 1.8 µm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱上开发的自动化保护柱氨基酸分析方法，现在还可使用 2.7 µm Poroshell HPH-C18 色谱柱。该色谱柱寿命长，不同规格色谱柱间的方法转换性好。

pH 耐受性更好，可防止堵塞

Agilent Poroshell 系列色谱柱基于表面多孔颗粒 (SPP) 技术，该颗粒包括一个实心核和一个表面多孔壳。该系列色谱柱填料有 2.7 和 4 µm 粒径两种规格。对于这里使用的 2.7 µm 填料，颗粒包括一个 1.7 µm 的实心核与一个 0.5 µm 的多孔壳。它们使反压降低了 40% - 50%，并可提供相当于亚 2 µm 全多孔填料 80% - 90% 的柱效。而且，由于色谱柱使用了一个 2 µm 孔径的筛板，它们可与 3.5 和 5 µm 色谱柱一样起到防止堵塞的作用。直到最近，所有硅胶基质的 SPP 填料在较高 pH 值的缓冲液中仍具有有限的寿命。为了延长其寿命，我们需要通过修饰颗粒表面或采用特殊的键合来保护基质颗粒。Agilent Poroshell HPH-C18 颗粒表面通过化学修饰形成有机层。该有机层可以防止硅胶在高 pH 值条件下溶解。

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图 1. 通过在 Agilent Poroshell HPH-C18 和 ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱上实现氨基酸和内标物的分离，证明可轻松实现方法转换

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Figure 2.Figure 2. Corresing Agilent Poroshell HPH-C18 and ZORBAX Eclipse Plus C18 columns.

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图 3. 使用 Agilent Poroshell HPH-C18，2.1 x 100 mm 色谱柱运行氨基酸分析方法进行的色谱柱寿命测试

相似的氨基酸分离

在图 1 中我们可以看到，使用相同的色谱条件，氨基酸的分离状况非常相似。在两根色谱柱上，混合物组分的流出顺序相同，两类色谱柱间样品组分的保留时间高度相关 (0.997)（图 2）。在 Agilent Poroshell HPH-C18 色谱柱上，保留时间略短。

在我们的实例中，亮氨酸和赖氨酸的分离在 Agilent Poroshell HPH-C18 色谱柱上看起来更好，但赖氨酸和羟脯氨酸，以及肌氨酸和脯氨酸看起来分离较差。不管怎样，方法可容易地扩展到不同规格的色谱柱上，通过改变色谱条件提高目标峰对的分离度。

流速随色谱柱内径呈几何级数地变化。流速在 4.6 x 100 mm 色谱柱上为 1.5 mL/min，而在 3 mm 和 2.1 mm 内径色谱柱上就分别变为 0.62 mL/min 和 0.21 mL/min。在所有情况下，使用小体积的热交换器和短的红色管线来尽量减小柱外体积。使用 Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱系统以及低扩散热交换器和管线时，柱压大约是 175 bar。

更长的色谱柱寿命

色谱柱寿命是色谱工作者分析氨基酸样品时需要考虑的一个重要事项。在长时间暴露于这些条件后，大多数硅胶基质色谱柱的柱效都会下降。

实现硅胶基质高效液相色谱柱在高 pH 条件下稳定的方法有两种。一种是使用特殊的化学键合相，如同 Agilent ZORBAX Extend-C18 色谱柱填料一样。该技术使用双配位基键合来防止硅胶溶解。另一种方法是对硅胶自身进行修饰，使它的溶解性降低，如同我们对 Agilent Poroshell HPH 填料的处理一样。

在我们的研究中，使用一根 2.1 x100 mm 色谱柱进行寿命测试，四周内进行了 500 次分析。使用新开的氨基酸标准混合物和试剂，每周大概完成 100 次进样。结束序列分析后，我们使用 100% B 流动相冲洗色谱柱 40 min，然后关闭仪器。运行该分析方法 3.5 天，然后将色谱柱保存 3.5 天，期间不进行任何分析。该方法模拟典型的实验室实际情况，样品延时运行分析一段时间后，将色谱柱冲洗并保存。原始氨基酸定量分析方法推荐在 100% 流动相 B 中保存色谱柱，这在许多频繁分析氨基酸的成功实验室中已成为惯例。实际寿命研究表明，使用一个月后，色谱柱的性能依旧保持不变（图 3）。