Access Agilent 电子期刊（2015 年 7 月）
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Agilent AdvanceBio 色谱柱涵盖
寡核苷酸分析的所有基础
作者：Stephen Luke
安捷伦反相生物色谱柱产品经理
合成的寡核苷酸作为有前景的治疗剂已崭露头角，可用于治疗包括病毒感染和癌症在内的多种疾病。研究人员正在对多类核酸的治疗应用进行研究，如反义寡核苷酸、小干扰 RNA (siRNA) 和适配体。
但是，必须鉴定并去除很多与产品相关的、原始材料中的、偶联反应中不完全加帽产生的杂质，并且必须监控合成后工艺。因此，寡核苷酸治疗药物开发和生产中的一个关键挑战是建立适当的分析方法分离并鉴定杂质。
发现更好的寡核苷酸液相色谱分离方法
三苯甲基化寡核苷酸的离子对反相分离操作相对较为简单。该方法从脱保护失败序列中分离仍带有 dMT 基团的全长靶标寡核苷酸。由于其得到的分析信息有限，因此这一步一般认为是纯化方法。
另一种脱三苯甲基脱保护寡核苷酸的离子交换分离方法利用寡核苷酸骨架上的负电荷进行分离。较短寡核苷酸的分离度良好，但分离度随链长增加而降低。使用水相洗脱液，但寡核苷酸高度带电荷，需要用高浓度盐从色谱柱上洗脱下来，因而该技术不适用于液质联用分析。
最终，离子对反相分离脱三苯甲基脱保护寡核苷酸的方法使用有机溶剂以及诸如 TEAA（三乙铵乙酸酯）或 TEA-HFIP（三乙胺和六氟异丙醇）的流动相添加剂，与寡核苷酸骨架中带负电的磷酸二酯形成离子对。高性能色谱柱提供绝佳的分离度。此外，由于该方法使用挥发性的流动相，例如 TEA-HFIP，使其可适用于液质联用分析，可提供表征寡核苷酸结构和序列的有用信息。
在表 1 中我们总结了液相分析寡核苷酸的一些选择。
技术 |
寡核苷酸 |
备注 |
|---|---|---|
离子对，反相 |
带三苯甲基 |
对杂质的分离度低，但是一种较好的纯化技术 |
离子交换 |
脱三苯甲基脱保护 |
较短寡核苷酸分离度较好，不与质谱兼容 |
离子对，反相 |
脱三苯甲基脱保护 |
杂质的分离度较好，且与质谱兼容。需要高性能色谱柱。紫外检测采用 TEAA 为流动相，质谱检测采用 HFIP-TEA 为流动相。 |
表 1. 寡核苷酸液相色谱分离的选择
Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱适用于采用 TEAA 或 TEA-HFIP 流动相进行脱三苯甲基脱保护的寡核苷酸的离子对反向分离，可应对上述挑战。
实现更好的分离度、更长的使用寿命
想要成功实现脱三苯甲基脱保护的寡核苷酸的离子对反向分离，您需要具有较高分离能力并且可以耐受恶劣环境的色谱柱。如果没有足够的分离度，测量的准确度和精度都会有所损失，从而导致分析结果可信度的降低。而色谱柱如果不够稳定，将会缩短其寿命，需要频繁进行更换，因而破坏了整体工作流程，并且增加了费用。
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图 1. Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱在 N/N-1 寡核苷酸分析中可获得尖锐的色谱峰以及较高的分离度
安捷伦寡核苷酸分离标准品可提高峰性能
Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱拥有高效的 2.7 μm 表面多孔 Poroshell 填料。填料采用专利技术进行化学修饰，使其能很好地耐受高 pH 的流动相。这些填料与封端 C18 固定相键合，从而为寡核苷酸分析提供出色的选择性。为了确保分离性能，每一批次的 AdvanceBio 寡核苷酸介质均使用安捷伦寡核苷酸分离标准品进行了测试。
分离只有单个核苷酸不同的寡核苷酸对于准确表征十分重要。图 1 展示了 AdvanceBio 寡核苷酸 2.1 x 50 mm 色谱柱对 N/N-1 寡核苷酸的分离，可得尖锐的色谱峰以及良好的选择性。
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图 2. Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱采用 TEAA 流动相时可稳定使用约 400 针
良好的色谱柱稳定性可获取高度一致的结果
色谱柱稳定性是 Agilent AdvanceBio 寡核苷酸柱的另一个重要特征。图 2 展示了 AdvanceBio 寡核苷酸柱在使用 TEAA 流动相时可稳定使用超过 400 次进样。
利用质谱兼容性表征寡核苷酸结构和序列
液质联用分析可提供有用的信息有助于表征寡核苷酸的结构和序列。AdvanceBio 寡核苷酸柱在使用 HFIP-TEA 流动相时可实现较高的色谱分离度和质谱灵敏度。Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱结合精确质量数质谱可表征寡核苷酸的结构和序列，如表 2 和图 3 中所示。
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图 3. Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱结合精确质量数质谱可表征寡核苷酸的结构和序列
色谱峰 |
响应 |
% |
|---|---|---|
FLP |
5089897 |
44.33% |
FLP-1 |
1656225 |
14.42% |
FLP-2 |
304129 |
2.65% |
FLP-3 |
303848 |
2.65% |
FLP-4 |
218243 |
1.90% |
FLP-5 |
113062 |
0.98% |
FLP-6 |
104555 |
0.91% |
FLP-7 |
110327 |
0.96% |
FLP-8 |
134341 |
1.17% |
FLP-9 |
134080 |
1.17% |
FLP-10 |
186947 |
1.63% |
FLP-11 |
358833 |
3.12% |
FLP-12 |
251690 |
2.19% |
FLP-13 |
272844 |
2.38% |
FLP-14 |
416306 |
3.63% |
FLP-15 |
238205 |
2.07% |
FLP-16 |
304333 |
2.65% |
FLP-17 |
403038 |
3.51% |
FLP-18 |
459344 |
4.00% |
FLP-19 |
422518 |
3.68% |
总和 |
11482765 |
100% |
表 2. 寡核苷酸杂质图谱
适用于寡核苷酸分析的安捷伦生物色谱柱系列
我们已经展示了 AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱可用于脱三苯甲基脱保护寡核苷酸的离子对反相分离。该色谱柱能提供绝佳的分离度，且方法可使用挥发性流动相成分，适用于液质联用分析。该分析还可提供有用的信息有助于表征寡核苷酸的结构和序列。如果您希望采用离子对反相分离/纯化带三苯甲基寡核苷酸的方法纯化寡核苷酸，那么安捷伦的生物分子 PLRP-S 色谱柱是一个很好的选择。对于离子交换分离脱三苯甲基脱保护的寡核苷酸，安捷伦的生物分子 PL-SAX 色谱柱可为较短的寡核苷酸提供良好的分离度。无论您对生物分子分析的要求如何，都可在我们的生物色谱柱系列中找到符合您要求的安捷伦解决方案。
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