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咨询专家：如何分析多聚糖、聚集体和电荷异构体？

作者：Koen Sandra
比利时色谱研究所

和 Andrew Coffey
安捷伦生物制药应用化学家

上个月关于生物仿制药分析的文章中，我们了解了使用反相液相色谱检测完整结构并获得肽谱，并且当该技术与质谱联用时，这种组合将提升结果的可信度。本月，我们将重点关注其他来源的结构变体，这与可靠生产治疗性 mAb 过程中的了解、检测和控制同等重要。

问：为什么多聚糖很重要？

答：许多蛋白质进行翻译后修饰，将低聚糖结合到其表面。这些被称为多聚糖的糖类通过酶促反应结合到关键氨基酸的侧链上，例如天冬酰胺（N-连接）、丝氨酸或苏氨酸（O-连接）。它们在确保蛋白质正确折叠中发挥重要作用，或可参与分子识别或信号传导通路。尽管治疗性 mAb 中糖基化水平很低（通常为重量的 3% 至 4%），但是某些治疗性蛋白中浓度要高得多（促红细胞生成素的多聚糖含量高达 40% w:w）。

由于多聚糖在抗体依赖、细胞介导细胞毒性以及补体依赖细胞毒性中有潜在作用，因此表征和控制多聚糖结构在治疗性 mAb 生产中是至关重要的。除了用于蛋白质表达的细胞系，多聚糖结构还受到发酵条件的影响，如溶解氧和二氧化碳的含量，甚至反应器设计都可以影响多聚糖的结构。

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图 1. 使用 1.8 µm 和 2.7 µm HILIC 色谱柱分离赫赛汀 N-糖链

问：如何分析多聚糖？

答：为了表征蛋白质 N-糖基化，多聚糖应首先通过 PNGase F 酶裂解从变性蛋白中释放出来。然后使用专门为此设计的 Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱通过亲水作用色谱 (HILIC) 分离释放的多聚糖。尽管糖类分析前，通常会使用配备荧光检测器的 HPLC 系统通过 2-氨基苯甲酰胺 (2-AB) 进行标记，但是梯度洗脱条件与质谱检测是兼容的。后续的衍生化步骤还增加了多聚糖的电喷雾离子化效率。新的 HILIC 色谱柱还能够完成高分离度多聚糖分离。图 1 显示了使用亚 2 µm 全多孔颗粒或 2.7 µm 表面多空颗粒分离从赫赛汀酶促释放的 2-AB 标记的 N-糖链。

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图 2. 通过 WCX 对完整赫赛汀的重复分析 (n=5)

问：如何分析电荷异构体？

答：从大而复杂的生物分子中测量和定量电荷异构体的含量是一个巨大的挑战。最适合的技术是使用配备 Agilent Bio IEX 色谱柱的离子交换色谱 (IEX)。由于大多数治疗性 mAb 含有较多的碱性残基，所以经常会使用阳离子交换色谱。使用阳离子交换色谱的优势是不需要将蛋白质变性；温和水性条件下即可进行 mAb 的完整分析。通常使用长色谱柱和平缓梯度来提高分离度。弱阳离子交换 (WCX) 色谱柱的选择性一般比强阳离子交换色谱柱高。有些 WCX 色谱柱是专门为 mAb 优化过的，例如 Agilent Bio MAb。无论您选择哪种 IEX 色谱柱，都必须针对每种产品进行方法开发和优化，严格遵守涵盖流动相离子强度和 pH 的“质量源于设计”的方法至关重要。图 2 显示了通过 WCX 对赫赛汀进行的重复分析结果以及在主峰前的天冬氨酸脱酰胺作用的分离度。所提供的精度使得该技术非常适用于不同生产批次之间，以及创新生物药物和生物仿制药的之间对比。

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图 3. 赫赛汀与生物仿制药的 SEC 分离对比

问：为什么要分析聚集体？

答：测量和控制聚集体至关重要，因为聚集体能够激发免疫反应。这些反应可能会产生副作用，如过敏性休克。致力于生产高效、安全的治疗性 mAb，用于体积排阻色谱的安捷伦生物柱是您的不二选择。

蛋白质能形成二聚体或更大的聚集体，甚至还能降解成片段，例如 lgG 分子的重链和轻链组分特征。在生物仿制药的生产过程中，确保高分子量和低分子量（HMW 和 LMW）异构体与原研药相似至关重要，以避免潜在的副作用。图 3 显示了赫赛汀与一种潜在生物仿制药的 SEC 分离对比，示出了其 HMW 和 LMW 数据的差异。

安捷伦生物制药解决方案

这些例子重点介绍了 mAb 表征的重要性以确保其最终使用的疗效和安全性，并阐述了一些针对不同特征您可以选用的不同液相色谱技术。在下期，本系列的最后一篇文章中我们将考察强大的软件工具，帮您加快分析。所有讨论示例的详细信息都可在我们免费提供的《制备生物仿制药》文集中获取。

从多聚糖分析和电荷异构体分离到聚集体定量分析，安捷伦为您提供高分离度的色谱柱，帮您深入了解生物仿制药。这些先进的方法将帮助您正确测定分子量、进行鉴定、测定纯度，并发现难分离的杂质。了解更多关于安捷伦生物制药解决方案的信息，以帮助您推动生物制药研究进展。

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