Access Agilent 电子期刊，2015 年 2 月
>> 更新资料 | 订阅 Access Agilent | 文章目录
DNA 完整值为消除较差质量测序样品提供了客观证据
作者：Eva Schmidt 博士
安捷伦产品经理，DNA 完整值 (DIN)
由于福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织常用于临床样品保存及归档，因此可为新一代测序 (NGS) 研究提供十分有价值的资源。从 FFPE 样品中提取 DNA 具有一定的挑战性，且常常只能获得少量的可用于 NGS 的 DNA。这些 DNA 样品需经受长时间的 NGS 样品前处理工作流程，且只能通过最终的测序步骤才可得知所获取的 DNA 是否合适。为了节省时间，Agilent 2200 TapeStation 可评估初始基因组 DNA (gDNA) 的质量，从而可客观排除低质量的样品用于进一步的处理及测序。本文展示了一个制药实验室如何利用该方法获取成功的例子。
Theragen Etex 是一家专业的基因组学公司，其利用基因组学及生物信息学技术开发了多个创新性的诊断工具及新药。该公司现在正在开展一项采用 FFPE 癌症组织样品进行新一代测序的项目，其中使用 Agilent SureSelectXT 系统进行文库建立，并使用 Agilent 2200 TapeStation 系统进行工作流程中的质量控制。
采用数值质量评估代替主观评估
安捷伦让韩国团队（如图 1 所示）更早地接触了基因组 DNA ScreenTape 分析的新功能，即 DNA 完整值 (DIN)，用于评估 DIN 是否能为 FFPE 组织中提取的 gDNA 样品提供合适的质量标准。该新特性在最新版本（A.01.05 版）的 Agilent 2200 TapeStation 软件中提供。除了之前提供的有关基因组 DNA 样品的分子量及质量信息，您现在可用 DIN 对 gDNA 的完整性进行评估，数值从 1 到 10。高 DIN 表示高度完整的 gDNA，低 DIN 表示高度降解的 gDNA。
放大图片
图 1. Theragen ETEX 团队采用安捷伦的仪器及软件加快 NGS 文库构建
放大图片
图 2. 安捷伦 DNA 完整值 (DIN) 为 FFPE 组织中提取的 gDNA 提供客观的质量测定方法
放大图片
图 3. 在 FFPE 癌组织中提取的 197 个 gDNA 样品中，将 2200 TapeStation 系统及基因组 DNA ScreenTape 分析法所测得的 DIN 分别对击中率 (A)，10x 的覆盖率 (B)，以及去重率 (C) 作图
韩国研究人员最初通过主观检测基因组 DNA ScreenTape 分析所得的样品分子量分布进行 gDNA 质量评估。只需将 2200 TapeStation 分析软件轻松升级至 A.01.05 版，他们即可利用 DIN 算法重新分析原有数据。图 2 阐释了主观评估 gDNA 样品的电泳图（左图）或胶图（右图）的难度。然而，新版软件可在胶图下及数据表中显示 DIN，通过量化数据取代主观表征。
DIN 与测序结果的质量相关
从 FFPE 癌组织中提取的 751 个 gDNA 样品的研究证明 DIN 与下游测序结果的质量直接相关。采用安捷伦基因组 DNA ScreenTape 分析法分析 gDNA，DIN 在 1 至 7.8 之间。从 DIN 1.5 至 6.4 的样品中随机选取样品子集，进一步按 Agilent SureSelectXT 工作流程处理。将击中率超过 70% 作为测序成功的参数。10x 覆盖率（目标为大于 90%）及去重率（目标为大于 80%）可作为附加的质量标准。
作为 NGS 工作流程的一部分，由于输入的 gDNA 是碎裂的，因此您可能会认为一个样品的初始分子量分布对测序结果的质量并没有显著的影响。但是我们的数据清晰地指出正好相反。所得的 DIN 与击中率直接相关，后者为测序结果的主要成功参数（图 3A）。所选取的样品子集中约三分之一达不到至少 70% 的击中率要求。这些样品的完整性分析显示 97% 的样品的 DIN 值低于 3。
虽然大部分样品在 10x 时均可达到 90% 的靶标覆盖率，但是 DIN 小于 3 的样品表现出更大的差异（图 3B）。与之相反的是，DIN 与去重率之间并无任何明确的相关性（图 3C）。
减少了近 50% 的样品数进行 NGS 处理，从而节省了大量的时间和成本，并可显著促进 NGS 项目的推进。
工作量大大下降
基于初始样品完整性的分析及击中率和 10x 覆盖率的相关性，在后续的测序中将 DIN 阈值设置为 ≥3。在所选取的数据子集 (n=197) 中， 49% 的样品未达到 DIN≥3 的标准。DIN 小于 3 的样品不进行任何进一步处理及测序，从而减少了一半的工作量。
降低成本：只处理符合条件的样品
可自动计算 DIN 的 Agilent 2200 TapeStation 系统是 FFPE 组织中提取 gDNA 样品进行高通量筛查的最佳工具。DIN 与测序质量的重要参数相关，且可客观排除样品以避免进一步的处理及测序。NGS 工作流程的工作量很大，且每个样品成本很高，因此采用 DIN 进行样品质量评估具有很大的优势。
除了 DIN 之外，从 FFPE 组织中提取的 gDNA 量对下游测序的成功也很关键。Agilent 2200 TapeStation 系统可同时测定 DIN 及总样品浓度。
如果您的实验室必须降低成本，请查看安捷伦应用简报 5991-5360EN 以了解该研究的更多细节。如需了解更多有关基因组 DNA ScreenTape 分析及 DIN 的信息，请访问我们的产品页面。
>> 更新资料 | 订阅 Access Agilent | 文章目录
