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使用窄分子量标准品校准 GPC/SEC 色谱柱组是一种测量样品分子量分布的行之有效的常规技术。重新考虑如何及何时在 GPC 应用中使用标准品能够显著改善结果的准确性和可靠性。其他优势包括改善重现性、更早发现问题以及缩短故障排除时间和系统停机时间。

本文介绍了一些使用校准曲线改善 GPC 检测结果质量的简易提示。

选择适合您应用的最佳标准品

校准标准品的选择取决于溶剂。四种广受欢迎的常见标准品适用于大多数应用（表 1）。

为减少分子量计算过程中的外推误差，在理想情况下，标准品应当涵盖整个色谱柱的分离范围。通过校准整个色谱柱范围，可提高长时间内校准样品与未知样品比较的可重现性。

洗脱液类型	溶剂	标准配置
有机洗脱液	四氢呋喃 (THF)、氯仿、甲苯	聚苯乙烯（或者聚甲基丙烯酸甲酯）
极性有机物或有机物与水的混合物	二甲基甲酰胺 (DMF)、N-甲基-2-吡咯烷酮 (NMP)	聚乙二醇/氧化物（或者聚甲基丙烯酸甲酯）
水	水	聚乙二醇/氧化物

表 1. GPC/SEC 溶剂和校准标准品

恰当的制备过程可确保准确性

校准标准品必须正确制备，以免产生假峰或得到错误的校准曲线，或造成堵塞。如果标准溶液完全溶解于不含颗粒物的流动相中，则无需对其进行过滤。不得涡旋、超声或振荡标准溶液，因为高剪切操作可能改变分子量。

标准溶液的浓度至关重要，浓度过高会导致组分的传质速度减慢和谱带增宽，而浓度过低会导致信噪比过低而无法测量峰的重现性。在图 1 中，可以看到使用不同浓度标准品所得到的结果。如下方表 2 所示，所有聚合物溶液的最佳浓度取决于标准品/样品的分子量。

分子量 (g/moL)	浓度（重量比体积）
<5000	<1.0
5000 至 25000	<0.5
200 到 400000	<0.25
200 到 2000000	<0.20
10000000	<0.05

表 2. 标准品分子量及对应的浓度

为确保溶解性并避免出现假峰，必须将标准品溶解于等量的流动相中。分子量较高的标准品需要较长时间才可完全溶解，某些溶剂/标准品还需要加热。必须使加热温度比溶剂沸点低 10 °C，以免发生热降解而形成拖尾峰。

技巧如下 — 预先制备的标准品（例如 Agilent EasiVial 和 Agilent EasiCal 能够简化制备过程并减小误差。为简化浓度的影响，还可使用经过预先称量的预配制试剂盒。

合适的标准品数量是成功校准的基础

校准曲线一般有 10 到 12 个数据点，这样才足以获得准确的多项式回归结果。如果无法校准色谱柱的整个分子量范围，可使用线性扩展范围的色谱柱，例如 Agilent PLgel MIXED。可进样分析分子量标准品混合物（每种混合物包含三到四种标准品），减少获得 12 个数据点所需的分析时间。所有组分达到基线分离可确保结果具有极高的重现性。

定期、按计划配制新标准品非常重要

最好每周配制新的标准品。PEO 和 PEG 需要储存在冰箱中，但在使用前应当使其恢复至室温。

利用分子量标准品优化系统

GPC 分子量标准品具有窄分布多分散性，因此有助于完成许多统计测量，例如谱带展宽、柱效、峰对称性、分离因子以及每 10 个分子量单位的特定分离度。

甚至样品前后简单的校准叠加也能够提高结果的可靠性并提示您系统是否存在不一致。将任何此类测量融入标准操作程序都将大大改善长时间内结果的相对标准偏差并缩短仪器的停机时间。

经常校准可提高数据的可信度

在连续工作中，每天都要校准。对于内部验证，每周进行校准即可。无论何时更换 GPC 系统的任何组件或洗脱液，都需要重新校准。为保证最优的性能，建议对每个色谱柱组插入校准品以提高数据的可信度。GPC 系统存在使用期限，多个组件会随时间发生性能下降。仪器问题（例如滤芯堵塞、单向阀堵塞、进样器密封垫泄漏以及连接头泄漏或堵塞）会影响校准结果。此外，导致色谱柱性能逐渐下降的任何退化（例如滤芯堵塞或部分堵塞或者污染物积聚）也具有显著的影响。

重视定期校准色谱柱有助于利用仪器和色谱柱获得最佳的 GPC 结果。如需了解更多提示，请参阅免费的《GPC 色谱柱校准 — 最佳实践指南》。

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