Access Agilent 电子期刊（2015 年 8 月）

咨询专家：软件在生物仿制药分析中的作用是什么？

作者：Ning Tang
安捷伦生物制药应用化学家

在这个由四部分组成的系列文章中，前面部分着重描述用色谱技术来表征创新药和生物仿制药分子。而在这生物仿制药系列的最后一篇文章中，我们会探讨 LC/MS 数据分析工具，该工具可简化生物仿制药和原研药之间的比较，以提高效率并加快生物仿制药开发。

问：为什么软件如此重要？

答：生物制剂很复杂而且对制造过程中的变化非常敏感。参考创新产品是生物仿制药开发的重要组成部分。LC/MS 软件对于成功分析至关重要，因为它结合了多个强大的数据处理算法和复杂的序列以及数据库匹配工具。这些工具能够快速准确地识别简单和复杂混合物中完整的蛋白质、多肽以及它们的变异体。

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图 1. A) LC/MS 获得的完整赫赛汀（曲妥珠单抗）的电荷范围。B) 曲妥珠单抗最大熵解卷积结果。C) 曲妥珠单抗的峰建模解卷积结果

让我们来看看 Agilent MassHunter BioConfirm 软件以及其独特的功能，这功能让它在生物仿制药分析中脱颖而出。该软件提供了几种用于质谱解卷积的不同算法，针对完整蛋白质和多肽，以及不同样品的复杂性进行了优化。在使用电喷雾离子化条件下，质谱的电荷范围包含几个多电荷峰（图 1A）。安捷伦最大熵解卷积算法将这些复杂的谱图转变成简单的零电荷谱图（图 1B），直接提供了蛋白质及其变异体的分子量。

该方法将一个或多个完整蛋白质的 m/z 原始谱图转换为最可能的零电荷质谱。最大熵解卷积能可靠地处理不太复杂的蛋白质数据和相对简单的蛋白质混合物数据。

问：假峰是否得到改善？

答： Agilent MassHunter BioConfirm 提供了另一种先进的数据解卷积算法 — 峰建模解卷积 (pMOD)，通过采用自动峰建模技术改善了解卷积的结果。该算法提供了最可能的解卷积结果，几乎无假峰。pMod 可改善信噪比和蛋白质峰间分辨率，实现蛋白质的精确分析（图 1C）。

这一算法起源于最大熵解卷积方法。然后，根据最大熵解卷积结果，pMod 无需人工干预可自动生成质谱峰模型，并将这些模型应用到整个拟合和验证过程中。与模型不匹配的谱图数据均会被当作噪音去除。因此，与最大熵解卷积结果相比，pMod 结果更清晰，产生更少的假峰。采用该过程，pMod 可生成高分辨的零电荷质谱图和一组对每个峰质量准确度的评估。

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图 2. 完整原研药与生物仿制药的镜像图

问：如何比较不同变异体的数量？

答：镜像图是这项任务的理想选择。在生物仿制药开发过程中，生物仿制药与原研药之间分子相似性的比较至关重要。与小分子药物不同，生物制剂是异质性的并存在多种修饰，如糖基化。精确测量蛋白质量数并确定所有变异体只是生物仿制药鉴定的第一步。比较不同变异体的相对丰度也很重要。通常情况下，直观的比较能最直接地确认两个生物制剂之间的相似性。Agilent MassHunter BioConfirm 可产生两个样品的镜像图（图 2）以完成对比。

本示例采用 LC/Q-TOF 对原研药和生物仿制药进行分析。准确确定了蛋白质分子量，并鉴定了主要糖型。对解卷积质谱图进行镜像绘图以便于比较。黑色曲线为赫赛汀（曲妥珠单抗），红色曲线为生物仿制药。蓝色曲线是两个样品之间的差异。近平坦蓝线显示这两个样品在完整水平上具有很大的相似性。

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图 3. 赫赛汀和生物仿制药胰蛋白酶肽谱分析色谱的镜像图

问：有没有一种可以加快肽谱分析的方法？

答：肽谱分析是鉴定生物制剂的一个重要步骤。然而，因为多肽混合物包含许多组分，所以对 LC/MS 结果进行手动分析非常耗时。Agilent MassHunter BioConfirm 提供分子特征提取 (MFE) 算法以自动化该过程。MFE 可从 LC/MS 色谱图中找到多肽，并通过分辨的同位素解卷积确定其质量数。然后使用分辨的同位素直接测定多肽的电荷态，并寻找代表相同多肽的具有相邻电荷态的相关离子簇。

BioConfirm 的比较分析模块对于两个不同样品的分析非常重要，如生物仿制药和原研药。该模块能直观比较两个肽谱分析样品的不同 LC/MS 谱图。镜像图和表格对比可以很容易地直观比较样品，如图 3 所示。