Access Agilent 电子期刊 2015 年 4 月
>> 更新资料 | 订阅 Access Agilent | 文章目录
采用高灵敏度、高分辨率的 Agilent 3D-DIP-芯片来测定基因组 DNA 损伤
作者：Nigel Skinner
安捷伦全球市场营销经理
基因毒素会损伤 DNA， 如果损伤未得到恢复，将会产生多种遗传突变，具有深远的影响。这种损伤会导致多种与诸如癌症等疾病相关的基因畸变。基因组技术的最新进展可针对基因毒素的影响进行全基因组分析，包括损伤诱导的转录组学、蛋白质组学和代谢组学的变化。为了加速这项研究，安捷伦开发了一种高灵敏的 DIP-芯片方法，其中采用 DNA 免疫沉淀 (DIP) 以及微阵列芯片测定基因组内基因毒素诱导的 DNA 损伤的位置及级别。
基因组技术大大提高了我们测试新型化合物安全性的能力。[1] 此外，测序技术的发展可实现全基因组的突变分析。单个癌症基因组的测序揭示了癌细胞中存在突变信号。[2] 这些信号反映了人在一生中暴露于多种基因毒素的总和，以及细胞修复 DNA 的能力。这些研究彻底改变了我们对天然产品和人工产品对疾病发展及治疗影响的看法，使得个体化医疗具有极大潜力。
放大图片
图 1. 此图展示的 Agilent 3D-DIP-芯片及 ChIP-芯片流程有助于在已测序的基因组中实现高分辨率 DNA 损伤定位
优化工作流程可提供详细结果
图 1 展示了 3D-DIP-芯片的流程。首先，我们从细胞中提取受损 DNA 或交联染色质 (A)。然后通过超声将其碎裂成适合微阵列芯片的片段长度。通过免疫沉淀 (IP) 捕获 DNA 片段，其中使用磁珠作为载体，所使用的抗体能与特异类型的 DNA 损伤或目标染色质结合蛋白相结合 (B)。
IP 之后，释放损伤或交联片段，并采用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 对样品进行评估从而实现质量控制。然后采用全基因组扩增或连接介导 PCR 对 DNA 进行扩增。采用安捷伦 SureTag DNA 标记试剂盒对 IP 样品及各个输入样品进行差异标记 (C)。
然后使用安捷伦 ChIP-on-Chip 杂交试剂盒将样品杂交至微阵列芯片中，并使用安捷伦 ChIP-on-Chip 清洗缓冲液试剂盒进行清洗及干燥 (D)。根据安捷伦哺乳动物 ChIP-on-chip 实验方案，采用安捷伦 SureScan 微阵列芯片扫描仪对微阵列芯片进行扫描。最后，特征提取软件提供数据，我们采用 R 软件 Sandcastle 包进行分析并作图 (E) [3]。
放大图片
图 2. 由顺铂试剂导致的人类体内损伤。由于图 D 与图 C 的坐标轴标度相同，因此一些探针并未显示。
放大图片
图 3. Agilent 3D-DIP-芯片及 ChIP-芯片的一些分析实例之间既有正相关也有负相关。
微阵列芯片处理及数据分析可精确定位 DNA 损伤
我们分析了人类和酵母源样品以测定 DNA 损伤的相对水平及位置。将这些样品与双色安捷伦 4 × 44K 微阵列芯片杂交，芯片为人类定制设计（可覆盖染色体 17 中的 10 Mbp 区域）或者为酵母全基因组芯片。所有分析采用 log2 IP:IN 值，其中输入通道 (IN) 根据 DNA 总量的相对差异进行了校正。该流程可获得 DNA 加合物的相对浓度，加合物在基因组的位置由微阵列芯片中的探针或特征进行表示。
图 2 A 为 Circos 图，表示了两个体内人顺铂处理后数据集的平均值。可在超过 10 Mbp 的基因组区域内观察到 DNA 损伤分布的异质性。图 2B 展示了一个 25 Kbp 区域，以及两个数据集的平均值（黑色线）及标准差（灰色阴影）。由顺铂 (C) 及奥沙利铂 (D) 各自总数据集的散点图可知，整体重现性良好。
我们测定了人类 DNA 中两种不同形式的基因组 DNA 损伤：化学（铂）诱导的损伤及 UV 诱导的嘧啶二聚体损伤（图 2 和 3）。基因损伤还会诱导组蛋白修饰形式的表观遗传变化 [4,5]，这些变化会影响 DNA 损伤的诱导及 DNA 修复。为了观察这两个参数在经受基因毒素后相互之间的关系，我们采用上述两类基因毒素处理酵母细胞。此外，我们采用 ChIP-芯片测定 DNA 损伤诱导的组蛋白 H3 中赖氨酸 9 (K9) 乙酰化 (H3Ac) 的变化，此过程是有效修复 UV 诱导的环丁烷嘧啶二聚体所必须的（图 3）。
在图 3 中，散点图展示了顺铂及 UV 诱导的 DNA 损伤之间为负相关 (A)，而顺铂及 UV 诱导的组氨酸乙酰化之间为正相关 (C)。在转录起始位点 (TSS) 作图，显示了不同的损伤诱导模式 (B)。阴影区域展示了所有 TSS 的标准差。相同 TSS 附近的组蛋白乙酰化对两种损伤因子的响应模式类似 (D)。
测定基因组 DNA 损伤的更优方法
如今，安捷伦 DIP-芯片分析法可用于测量人类细胞中多种类型的 DNA 损伤，并且具有极高的灵敏度和分辨率。该方法展现了在基因组水平进行基因损伤测量的显著技术优势。它为测定人类及其他细胞中的基因组 DNA 损伤提供了一种新方法。请花几分钟了解更多有关安捷伦基因调节解决方案的信息。
参考文献
- Perkel, J. M. Science, 2012, 335, 1122–1125.
- Alexandrov, L. B. Nature, 2013, 500, 415.
- R: Development Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R: Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2011.
- Yu, S. et al. PLoS Genetics, 2011, 7(6), e1002124.
- Guo, R. et al. Nucleic Acids Res. 2011, 39(4), 1390–1397.
>> 更新资料 | 订阅 Access Agilent | 文章目录
