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使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱优化生物仿制药的效价

作者：Phu Duong，James Martosell 和 Maureen Joseph
安捷伦生物色谱柱应用专家

在最近的一个研究中，研究人员将安捷伦的 Bio-Monolith Protein A 色谱柱用于阐明分离和监测曲妥珠单抗生物仿制药的效价以进行细胞克隆选择。通过 Protein A 柱对曲妥珠单抗生物仿制药进行纯化，然后进行质谱 (MS) 分析，展示了 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱在细胞培养选择方面的能力，和曲妥珠单抗的糖基化测定中的最佳条件选配。

Bio-Monolith Protein A 是 Agilent Bio-Monolith HPLC 色谱柱家族的成员之一，可用于分析生物大分子。

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图 1. 使用效价分析将曲妥珠单抗生物仿制药和来自收获细胞中未键合的蛋白裂解物与曲妥珠单抗原研药进行对比

轻松绘制曲妥珠单抗糖基化谱图

图 1 所示为含有曲妥珠单抗生物仿制药的样品裂解物和来自收获细胞中未键合蛋白的裂解物的效价分析，与曲妥珠单抗原研药作直接对比。对 0.5 mg/mL 的曲妥珠单抗原研药和选定克隆体 (#9) 的 0.5 mg/mL 曲妥珠单抗生物仿制药的谱图进行叠加比对，洗脱液为 0.1M 的柠檬酸，pH 2.8。曲妥珠单抗原研药和生物仿制药的 mAb 峰面积和保留时间具有良好的匹配度。

对曲妥珠单抗生物仿制药（克隆 #9）进行 Protein A柱纯化后，mAb 峰被采集并还原为轻链和重链。通过液质联用系统对包括轻链和重链分子量以及糖基化在内的几个参数在脱盐后进行测定。虽然生物仿制药克隆体的分子量与原研药匹配良好，但仔细观察会发现，在糖基化图形上还是存在某些差异。G0F 是克隆体的过度表达，G1F 为弱表达。因此，生物仿制药克隆体的效价需要进行调节，以匹配原研药的表征谱图（糖基化）。

与原研药相比，通过克隆衍生的生物仿制药包含了较少的半乳糖，而 G0F 占据了主导地位。为使糖基化纳入原研药的特性内，我们向细胞培养基中添加不同浓度的尿苷、半乳糖和锰（4 倍，8 倍，16 倍，24 倍）进行调节。调节后效价用 Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱进行测定。图 2 为克隆体 #9 细胞培养基优化后的效价结果。未添加额外营养素的结果与 4 倍添加浓度的结果类似，可以看到 24 倍添加浓度下所得的结果出现大幅下降。

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图 2. 克隆体 #9 细胞培养基优化后的效价结果示例，无额外营养素添加以及 4 倍添加浓度的结果类似，而 24 倍添加浓度的结果显著降低

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图 3. 曲妥珠单抗生物仿制药的克隆体 #9 糖基化调节结果

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表 1. 曲妥珠单抗克隆生物仿制药与原研药匹配的证明

此分析中我们使用液质联用系统评估 G0F 和 G1F 浓度的调整。从 4 倍浓度开始，G1F 出现显著上升（图 3）。表1 将四个批次的原研药与生物仿制药克隆体 #9 进行了对比。结果很明显，G0F 出现降低，G1F 出现升高，这与原研药的结果一致。数据，通过调节优化细胞培养基，使生物仿制药产品与原研药趋于匹配。

获取相同的一级序列

原研药与克隆衍生的曲妥珠单抗（调节后）具有相同的轻链和重链分子量。美国和欧洲的监管部门认为这是对生物相似性的最重要象征，即，一级序列应该相同。原研药和克隆衍生 mAb 的重链都包含有相同的聚糖，但是虽然从定性的角度来看有类似的糖基化，但定量上还存在一定的差别。

本文概述的方法可将克隆衍生的曲妥珠单抗的糖基化纳入原研药的特性内。效价随着锰、尿苷和半乳糖的添加浓度增加而降低。Agilent Bio-Monolith Protein A 色谱柱将克隆选择和纯化操作流程化，并在曲妥珠单抗生物仿制药接近于原研药的调节过程中,提供了关键的效价测定。

Agilent Bio-Monolith HPLC 色谱柱的高分辨率和快速分离特性

Agilent Bio-Monolith HPLC 色谱柱可为 IgG 和 IgM 抗体、质粒 DNA、病毒、噬菌体和其他生物大分子提供高分辨率的快速分离。该列产品提供有强阳离子交换、强阴离子和弱阴离子交换以及 Protein A 固定相。所有 Bio-Monolith HPLC 色谱柱都可与 HPLC 和制备型 LC 系统兼容。

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