Access Agilent 电子期刊，2014 年 6 月
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采用 Agilent 1260 Infinity Bio-MDS 实现更可靠的生物分析
作者：Graham Cleaver
安捷伦业务开发经理
Sonja Schneider
安捷伦应用科学家
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图 1. Agilent 1260 Infinity 多检测器 Bio-SEC 解决方案
单克隆抗体 (MAb) 的使用是人类抗肿瘤战役中的重大突破。特定类型的 MAb 可以触发免疫系统攻击恶性细胞，阻断导致细胞分裂的信号，或者携载治疗药物来干预细胞发育。体积排阻色谱 (SEC) 是用于鉴定和定量分析生物治疗蛋白质、多肽和疫苗中的单体、二聚体、聚集体和赋形剂的标准方法。SEC 也是相关注册审批中的常见技术要求。Agilent 1260 Infinity 多检测器 Bio‑SEC 解决方案（见图 1）包括 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统和 1260 Infinity Bio-MDS 系统，专为这些基于蛋白质的生物制剂和生物仿制药的高级分析进行了优化设计，重现性极高。我们已设计了一套完整的、用于专业和常规分析的仪器、色谱柱、标准品和软件，无论您的 SEC 或凝胶过滤色谱 (GFC) 的专业水平如何，都能使您轻松实现重现性好、准确度高的分析。
功能强大、易于使用的专用 Bio-SEC 软件
不管使用哪个实验室的哪台仪器，要确信能够获得相同的结果，良好的重复性和重现性非常关键。使用 Agilent Bio-SEC 软件，只需轻点鼠标，即可快速简单地确定基线和积分区域。我们可以建立和存储模板，以确保优异的重复性。
在表征生物分子时，确定其分子量和分子大小尤为重要。任何聚集体的存在都会显著影响其药效和安全性。光散射检测是监测甲状腺球蛋白及其聚集体的有效工具，如图 2 中所示。表中内容说明了峰 1 的摩尔质量比四聚体的大 10 倍，证实了它的确是一个聚集体峰。根据紫外检测信号计算了其峰面积百分比，代表了低聚体和聚集体的相对浓度。
采用 Agilent 1260 Bio-MDS 轻松表征蛋白质
Agilent 1260 Infinity Bio-MDS 系统在紫外或光电二极管阵列检测的基础上增添了静态光散射和动态光散射检测，从而成为蛋白质表征的最佳工具。无需校准色谱柱，我们即可测定其绝对分子量。动态光散射提供了溶液中生物分子的大小和形状信息。即使是最低浓度的蛋白质聚集体，我们也可以很容易地监测其组成和存在（图 3）。小体积光散射流通池提供了最大的检测灵敏度，并可确保结果的准确度。温控柱温箱和检测器流通池可实现优异的基线稳定性，且仅需极少的平衡时间。详情请参阅安捷伦应用简报：5991-3955EN。
真正的生物惰性流路
在药用生物分子的开发和生产期间，监测产品的稳定性必不可少。即使药用蛋白质中存在很低浓度的聚集体，也会导致负面的生理影响。
在我们测试分析期间，样品绝不会与任何金属表面接触。生物大分子，尤其是蛋白质，对非特异性表面相互作用、分析物歧视和金属离子释放非常敏感，这将导致重现性下降、色谱峰拖尾或分离度减小。另外，通常在 SEC 中使用的高浓度盐会产生腐蚀、降低耐用性并增加仪器停机时间。解决这些问题通常会要求特别小心的操作和繁琐的钝化处理过程，但通过使用该系统的全惰性流路，这些就都不需要了，确保能够提高任何生物分析实验室的样品分析通量和效率。
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图 4. 传统 SEC 分析柱校准 (A) 和 90° 时光散射分析 (B) 的比较
使用光散射检测单克隆抗体的优势
本例中，我们描述了根据 MW、Rh 和聚集体分析对 MAb 进行表征。根据对 MAb 聚集体的分析，论证了与单独使用紫外检测相比，使用光散射检测的优势。实现了 MW 的可靠测定，并与样品的进样量大小无关。当与高灵敏度 DAD 检测联用时，可对样品进行详尽的聚集体分析。
两张色谱图中均可清晰看到三个峰（图 4）。使用传统的 SEC 分析，第一个峰的分子量是 145000 Da，第二个和第三个峰的分子量分别是 1000 Da 和 100 Da。然而 90° 时的光散射分析表明，所见三个峰的分子量均为约 150000 Da。所有三个峰其实是相同的抗体，但由于抗体与色谱柱间的非特异性反应，其中某些部分在不同的保留时间流出。DLS 分析得到第三个峰的平均 Rh 是 5.23 nm（文献值为 5.29 nm），从而证实了上述结果。根据色谱柱校准结果，该大小的分子应在约 10 分钟时流出（流出的第一个抗 c-Myc 抗体峰的保留时间）。因此，抗 c-Myc 抗体不会在预期的时间流出，因为它可能吸附到色谱柱上。对于这种异常的流出行为其它可能的解释还包括变性导致的构像变化，或者不同的折叠过程（如非球形）。该实例说明了光散射检测器是一款对于生物化学家来说非常有价值的工具。该案例研究的更多信息请参阅安捷伦应用简报 5991-3954EN。
安捷伦提供了一整套液相色谱解决方案
安捷伦提供给生物化学家多种液相色谱工具和解决方案，包括 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统，它为生物分子的分析建立了性能、可靠性和耐用性的新标准。基于 1200 Infinity 系列液相色谱平台的成熟技术，1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱可以轻松应对常用于蛋白质和生物治疗制剂分析中挑战性的溶剂条件，并且可以尽量减少这些分子与金属表面的非特异性结合问题。您现在即可花一些时间来观看我们的关于安捷伦液相色谱解决方案的信息视频。
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