>> 更新资料 | 订阅 Access Agilent | 文章目录

实现更快速的肽图分析

作者：James Martosella 和 Alex Zhu
安捷伦生物应用

反相色谱肽图分析是生物治疗药物分析中最主要的技术，可为生物制药产品提供全面的表征。当与质谱仪联用时，能实现对蛋白质和变异体的鉴定，确定翻译后修饰及其位点，并确认蛋白质序列。

然而，由于蛋白质裂解物固有的复杂性，使得利用色谱进行肽图分析非常具有挑战性。因此，许多实验室都致力于开发稳定、可靠的肽图分析方法。通常而言，肽图分析受到灵敏度低、峰形差及需要较长分离时间来达到所需分离度的影响。

安捷伦全新的 2.7 µm AdvanceBio 肽图分析色谱柱填补了生物治疗药物表征的空白，能在液相色谱压力较低的条件下，高效快速地生成肽图。凭借表面多孔色谱填料，Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱在保持了高效峰性能的情况下，显著缩短了肽图分析运行时间。

放大图片

图 1. mAb 胰蛋白酶酶解物的快速高效液相色谱优化。上图：在 2.1 x 150 mm AdvanceBio 肽图分析色谱柱分离 75 min 获得了 59 个多肽峰。下图：在 2.1 x 100 mm AdvanceBio 肽图分析色谱柱上优化分离 14 min 获得了 57 个多肽片段峰

缩短分析时间且不影响结果

为了显示其出色的性能，我们使用 AdvanceBio 肽图分析色谱柱对单克隆抗体 (mAb) 胰蛋白酶酶解物进行了快速液质联用分析。通常情况下，mAb 多肽的肽图分析需要 2 小时或更长时间的平缓梯度，以获得所需的基线性能。较长的运行时间能确保获得最优的分离度，同时保证关键的 PTM 峰信息不会在较短的运行过程中丢失。而 Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱的灵活性能提高分析速度，并且对分离性能没有丝毫影响。图 1 中的液相色谱/紫外分离体现了这种灵活性。上面的色谱图显示了使用 2.1 x 150 mm 色谱柱，在 0.2 mL/min 的标准流速（同色谱柱内径相关）条件下运行 75 min 所获得的普通肽图。该分离提供了出色的基线分离度，在整个梯度程序范围内分离出了 59 个 mAb 胰蛋白酶酶解物峰。下面的色谱图是由 2.1 x 100 mm AdvanceBio 色谱柱，使用非常陡峭的梯度在 0.6 mL/min 高流速条件下运行非常短的时间（不到 14 min）而得到的色谱图。该分离中，mAb 胰蛋白酶酶解物峰的数量基本不变，为 57 个，同时基线分离度、峰形、灵敏度以及选择性也未改变。此外，色谱柱的背压也保持在 500 bar 以下，使得在常规高效液相色谱 (HPLC) 上也能获得这样快速高效的分离。

放大图片

图 2. Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱（红色曲线）和超高效液相色谱肽图分析色谱柱（黑色曲线）得到的 mAb 胰蛋白酶酶解物总离子流色谱图

放大图片

图 3. 76 种胰蛋白酶酶解 IgG 多肽片段提取化合物色谱图。上图：Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱，433 bar，所得序列覆盖率为 99.63%。下图：非安捷伦的超高效液相色谱肽图分析色谱柱，700 bar，所得序列覆盖率为 99.0%

在高效液相色谱压力下达到超高效液相色谱性能

通过使用较小粒径的色谱柱填料填充到更短的色谱柱中，能在较短的分析时间获得高效率的肽图分析，这就使得超高效液相色谱 (UHPLC) 肽图分析能为蛋白质生物治疗药物提供更详细的表征。但是，这种类型的分离对压力要求越来越高，不能在常规的 400 和 600 bar 高效液相色谱仪上进行操作，严重地限制了其应用范围。2.7 µm AdvanceBio 肽图分析色谱柱能提供同超高效液相色谱类似的肽图分析性能，同时也为与超高效液相色谱或高效液相色谱的联用提供了灵活性。

图 2 显示了 Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱和非安捷伦的超高效液相色谱肽图分析色谱柱的反相液质联用分离性能。总离子流色谱图之间的对比清晰地显示出了两者间非常相似的分离性能，表明 AdvanceBio 肽图分析色谱柱能完全且高效地分离 mAb 胰蛋白酶酶解物。其性能与超高效液相色谱/质谱分离相当，却只需使用高效液相色谱常用的 433 bar 压力。

在图 3 所示的提取化合物色谱对比图中，AdvanceBio 肽图分析色谱柱的高效液相色谱/质谱分析与超高效液相色谱/质谱色谱柱分析相比，具有更出色的序列覆盖率。Agilent AdvanceBio 色谱柱的序列覆盖率为 99.63%，而超高效液相色谱柱则为 99.0%。AdvanceBio 肽图分析色谱柱无需采用超高效液相色谱的压力就能获得与其相似的结果，这种灵活性使得该色谱柱能快速有效表征生物治疗药物，因而更具吸引力且适用面更广。

更多肽谱分析选择

安捷伦提供了全面的色谱柱和仪器产品系列，以改善肽图分析。下载 Better Characterization of Biomolecules Using Agilent AdvanceBio Reversed-Phase Columns（《使用 Agilent AdvanceBio 反相色谱柱对生物分子进行更好的表征》）的免费副本，了解如何使用 Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱及 Agilent 1290 Infinity 生物惰性四元液相色谱更快更好地进行肽图分析。

>> 更新资料 | 订阅 Access Agilent | 文章目录