Access Agilent 电子期刊（2014 年 1 月）
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体积排阻色谱：摘选自我们最新的使用指南
作者：Andy Coffey
安捷伦液相色谱应用专家
体积排阻色谱 (SEC) 常用于不同大小的生物分子的分离和定量。体积排阻色谱的机理是，较小的分子更容易扩散进出微孔中滞留的流动相从而导致迁移速度相对较慢。体积过大的分子不能渗透进微孔的孔状结构中，从而被微孔排阻，因而能快速流过色谱柱。较小的分子依据其体积的不同可以不同程度地渗透进微孔中，而最小的分子能在微孔结构中扩散得最深，从而最后洗脱出来（如图 1）。体积排阻色谱还能用于分析多分散分子的分子量分布，如淀粉和其他多糖。体积排阻色谱在确定治疗性蛋白质聚集程度（会产生免疫反应）的时候尤其有价值，并且常常用在方法开发和质量控制过程中，如 图 2 所示。
在成功的体积排阻色谱应用中，样品分子与色谱柱中的吸附剂之间不应发生相互作用。分子应该仅仅扩散进/出吸附剂微孔中的洗脱液滞留池。较大的分子不能轻易地渗透进微孔结构，所以它们会比较小的分子更快地流过色谱柱。该扩散过程意味着体积排阻色谱需要使用大尺寸色谱柱，且需使用较更为常见的高性能液相色谱技术低得多的流速（线速度）。
在选择体积排阻色谱前，需要考虑许多重要因素。所以安捷伦推出了全新的《用于生物分子分析的体积排阻色谱使用指南》。该手册能指导您选择正确的色谱柱、流动相、样品前处理和其他关键因素，帮助您最大限度地从使用体积排阻色谱技术中获益，是进行方法开发非常有用的参考。
正确的样品前处理技术保证正确的结果
这很重要。用于体积排阻色谱应用的样品前处理技术要求待测样品成分的性质完全未受影响。同所有色谱技术一样，确保样品中不含颗粒物非常重要。颗粒物可使用简单的针头过滤器轻松去除，如 0.2 或 0.4 µm 孔径的 Agilent Captiva PES 过滤器。然而，了解颗粒物的本质也很重要，将您试图测量的聚集体过滤出去这种做法肯定行不通。
使用体积排阻色谱时，通常需要进样体积较大的高浓度溶液，以获得足够的检测器响应。然而这样也可能导致样品组成的改变，所以在样品前处理方式选择上要多加小心。例如，使用超声或加热方式来溶解蛋白质可能会导致聚集体形成。
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图 3. SEC 方法开发指南
选择能涵盖所有目标分析物的色谱柱
选择正确的孔径可能是生物分子体积排阻分析最重要的因素。保证所有目标分析物至少能在一定程度上渗透进微孔结构十分重要。如果选择的色谱柱将一个或多个组分从微孔结构排阻开，那么该色谱柱将不利于获得好的色谱分离。对于大多数球状蛋白而言，300Å 是一个很好的选择，适用于多种情况。使用良好表征的标准品进行常规校准也是个很好的方式（图 3）。这能让您发现系统或方法的潜在问题。
别让流动相改变了您样品的成分
对于很多生物分子而言，使用含有磷酸盐和氯化物的水相缓冲液，如磷酸盐缓冲液 (PBS) 能提供必要的平衡，在保证样品溶解度的同时保证分析物和与填料间最低的非特异性相互作用。由于氯离子具有较高的腐蚀性，甚至能腐蚀色谱柱硬件和仪器零部件的不锈钢组件，因此中等强度的磷酸盐缓冲液可能是个更好的选择。虽然大多数其他盐类添加剂也适用，但是安捷伦推荐使用 150 mM 的磷酸盐作为洗脱液用于多种体积排阻应用。同样品前处理中所提到的一样，确保流动相不会改变待分析样品的组成很重要。
选择满足您生物应用要求的生物系统
当然，还有许多其他因素会影响到您选择色谱柱和分析条件。相关详细信息包含在安捷伦的《用于生物分子分析的体积排阻色谱使用指南》中，该指南可帮助您选择正确的色谱柱、系统和备件，实现可靠稳定的体积排阻色谱操作。
从样品纯化到分析，安捷伦生物分子色谱柱可以很容易地与您的工作流程集成，为您提供完整、可重现的高质量解决方案。生物分子的结构可能会很复杂，但是通过使用安捷伦生物色谱柱、系统和备件，如拥有无金属样品流路的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱和 Agilent 1290 Infinity 液相色谱。它们专为超高效液相色谱应用设计，能够提供最高的分析速度、分离度，以及超高的灵敏度，包括那些使用具有超高灵敏度的安捷伦大孔径 300Å ZORBAX 300StableBond 色谱柱进行超高效液相色谱分析的应用。
不管您针对的是哪种特定的生物应用，安捷伦都能提供帮助您执行可靠且可重现的体积排阻色谱分析的工具和资源。所以现在请花几分钟时间下载我们的《用于生物分子分析的体积排阻色谱使用指南》了解更多信息。
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