Access Agilent 电子期刊（2014 年 2 月）
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完善的法医/毒理学药物筛查
作者：Trisa Robarge
安捷伦样品前处理产品经理
在法医/毒理学分析中筛查生物样品中是否存在药物具有一定的难度，因为分析过程必须既快速又极其可靠。检测人员必须避免假阳性结果，满足严格的监管链规程要求，最大限度延长正常运行时间并保持从样品前处理到最终报告的端到端工作流程稳定运行。安捷伦提供的工具可帮助工作人员应对这些挑战并充满信心地执行与管制/非管制尿液、血液和唾液以及酒后驾车/法医药物、尸检毒理学和兴奋剂检测相关的常规分析。
本文重点介绍了两种在法医/毒理学应用中用以筛查药物的液质联用方法，这两种方法均采用简单的稀释-上样（用于尿液进样）或固相萃取（用于血浆等较复杂的生物基质）法。有关方法的详细信息，可在安捷伦应用简报 5991-1667CHCN 和 SI-01014 中获取。
尿液的稀释-上样分析 — 仅需数分钟
在第一个示例中，我们使用 Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱和 Agilent 6420 三重四极杆液/质联用仪开发了用于定量分析人类尿液中 65 种药物和代谢物的方法。向不含药物的人类尿液中加入 1000 ng/mL 所有 65 种化合物的标样，制成校准溶液。经稀释和酶解以及进一步稀释后，将样品注入 LC/MS/MS 系统。实验采用 Agilent Poroshell 120 SB-C18 色谱柱进行分离。使用安捷伦法医/毒理学数据库可以快速简便地完成分析方法（不论定制方法，还是综合方法）的开发。安捷伦动态多反应监测 (dMRM) 方法能够确保此类定量分析的准确度和重现性。
安捷伦 LC/MS/MS 仪器系统能够在指定时间段内分析更多的分析物而不影响数据完整性。利用该项技术，我们得以开发出适用于多种分析物的定量方法，该方法能够比传统 MRM 方法获得更高的通量。通过该方法，仅需六分钟即可完成对各种分析物成分及其同位素标记内标物的分析。使全套分析物组合中的同重分析物获得良好的基线分离非常重要。我们实现了吗啡/氢吗啡酮、可待因/氢可酮和甲基苯丙胺/芬特明的基线分离。
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图 1. 最大限度提高通量：在仅六分钟的一次运行中分离 65 种药物及其代谢物所得到的色谱图
在此类极端采集条件下可以满足所有典型的检测限要求，且所有分析物在各自线性范围内的准确度均高于 98%。实验使用信噪比测定值以及与各个分析物相关的较低丰度定性离子的变异系数 (%CV) 精度数据谨慎地确定检测限。图 1 显示了所有分析物的基质加标样品以及相应同位素标记内标物的叠加色谱图。[1]
使用稀释-上样进行样品前处理通常适用于分析尿液中的药物。但是，固相萃取可能是一种用于提取尿液及更复杂生物样品（例如，血浆、全血或组织）中药物的更可靠、一致的方法。
对血浆中的药物采用固相萃取，实现出色回收率
生物样品的分析可能很困难，因为其基质中存在蛋白质、多肽、盐类、磷脂及其他内源性化合物。因此必须通过样品净化除去这些干扰物，而同时又不能使目标分析物发生较大损失。将采用简化方法的固相萃取用于常规分析是去除基质、富集目标分析物的理想选择。
我们使用 Agilent Bond Elut Plexa PCX 萃取柱提取人类血浆中的非极性碱性化合物，然后通过 Agilent Pursuit C18 液相色谱柱进行分离（ 图 2 ）。固相萃取和 LC/MS/MS 分析的检测限为 1.0 ng/mL。回收率表现出色，表明实验中的保留和洗脱效果良好，并且离子抑制效应极低。所有评估化合物的响应线性范围涵盖三个数量级（1.0 ng/mL 至 1.0 μg/mL），相关系数均高于 0.999。
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图 2. 使用 Agilent Bond Elut Plexa PCX 萃取柱进行提取，通过 Agilent Pursuit C18 液相色谱柱进行分离，从血浆中得到的 50 ng/mL 药物提取物的色谱图
如表 1 所示，我们通过常规方案获得了可重现的高回收率。[2] 该方案适用于分析血浆及其他生物样品中的各种化合物。
分析物 |
log P |
pKa |
回收率百分比1 |
% RSD2 |
回收率百分比1 |
% RSD2 |
|---|---|---|---|---|---|---|
雷尼替丁 |
1.9 |
8.2 |
101 |
5 |
94 |
6 |
心得安 |
3.6 |
9.5 |
9.5 |
7 |
92 |
4 |
阿米替林 |
4.6 |
9.4 |
95 |
5 |
91 |
5 |
氯雷他定 |
5.2 |
9.3 |
100 |
4 |
91 |
4 |
1 根据萃取样品的信号强度与校准曲线信号强度的百分比计算得到回收率。
2RSD = 标准偏差/平均回收率 × 100；n = 6
表 1. 由人类血浆中得到的非极性碱性化合物表现出较高的回收率
安捷伦为法医/毒理学分析提供了各种解决方案
安捷伦各种先进的检测和分析设备提供了适合所有法医/毒理学流程的解决方案。除完整系列的样品前处理产品、液相色谱柱和气相色谱柱以外，我们的扫描和测量解决方案还包括：具有顶级灵敏度的单四极杆气质联用系统、日常性能稳定的液/质联用分析仪以及可实现先进自动化和工作流程管理功能的 MassHunter 和 OpenLAB 软件 。请联系您的安捷伦销售代表，详细了解这些产品。
参考文献
- P. J. W. Stone, K. McCann. 使用 LC/MS 全面分析尿液中的违禁药物和疼痛治疗药物及其代谢物. 应用简报，安捷伦科技公司，出版号 5991-1667CHCN (2013).
- W. Hudson, A. Junker-Buchheit. 使用 Bond Elut Plexa PCX 聚合物阳离子交换固相萃取柱萃取血浆中的非极性碱性药物. 应用简报，安捷伦科技有限公司，出版号 SI-01014 (2010).
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