Access Agilent 电子期刊，2014 年 8 月

软件辅助 Q-TOF LC/MS 进行遗传毒性杂质的鉴定

作者：Siji Joseph、Syed Salman Lateef、Vinayak AK 和 Sreelakshmy Menon
安捷伦应用科学家

药物的纯度是确保药物安全性和功效的关键因素，但是在处理或储存期间，药物的氧化降解会导致遗传毒性杂质的形成。由于监管机构已强调务必要严格控制药物中的遗传毒性杂质，因此，监测和鉴定这些痕量杂质就成为实验室所面临的一项艰巨的任务。在最新的研究中，我们成功应用安捷伦软件辅助四极杆飞行时间 (Q-TOF) LC/MS 方法来筛查和鉴定阿托伐他汀（通常以商品名立普妥进行销售）中潜在的痕量遗传毒性降解物。

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图 1. 使用安捷伦通用的硬件和软件产品套件成功完成这个多步骤工作流程

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图 2. 使用 HPLC-UV 方法监控降解的程度。非降解样品（蓝色）和降解样品（红色）在 244 nm 紫外光下分析所得的叠加图

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图 3. 非降解样品（蓝色）和降解样品（红色）分析所得的叠加总离子流图 (TIC) 。箭头指向已降解样品的有效峰

图 1 示出了本研究所采用的工作流程。我们使用 3% 的过氧化氢在 40 °C 下对阿托伐他汀钙药物处理 24 小时，使该化合物发生氧化降解。

采用 HPLC 方法显示降解的程度

使用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统，根据 USP 液相色谱方法监测降解程度（图 2）。在图中，我们将液相色谱中的一部分进行了放大，以说明两种新杂质的形成及杂质丰度的增加。我们使用了 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版（C.01.05 版）进行液相色谱系统操作。

本例中所使用的 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统的各个模块包括：

Agilent 1290 Infinity 二元泵
Agilent 1290 Infinity 自动进样器，配有 Agilent 1290 Infinity 恒温器
Agilent 1290 Infinity 柱温箱
Agilent 1290 Infinity 二极管阵列检测器，配有60 mm 最大光强流通池

对杂质进行 Q-TOF LC/MS 分析筛查

为了筛查杂质，我们采用配有安捷伦喷射流 (AJS) 双离子源的 Agilent 6530 精确质量四极杆飞行时间 (Q-TOF) LC/MS 系统对已降解和未降解的样品进行分析。使用 HPLC/Q-TOF 在正负离子模式下对样品进行分析以确认是否存在降解物。图 3 示出了非降解样品和降解样品分析所得的叠加总离子流图 (TIC) 。我们使用 Agilent MassHunter 工作站软件（B.05.01 版）来采集数据。

功能强大的软件工具帮助您查找并鉴定遗传毒性杂质

对照品（非降解）和降解样品之间的差异性杂质采用 Agilent MassHunter Profinder 软件（B.06.00 版）进行提取，然后通过 Agilent Mass Profiler Professional (MPP) 统计分析软件（12.65 版）进行分析。降解样品和非降解样品的统计分析结果表明大约有 15 种化合物出现了两倍的变化。本列表包括降解样品中发现的发生上调的杂质以及新形成的杂质。

使用这 15 种化合物的精确质量通过 ID 浏览器或 Agilent MassHunter 定性分析软件的分子式查找算法进行搜索。搜索了采用 Agilent MassHunter PCDL Manager（B.04.00 版）创建的精确质量数据库。该数据库包括已知杂质以及阿托伐他汀降解物的精确质量和分子式。通过搜索鉴定出了五种已知的杂质。

将经过 Agilent MassHunter 分子特征提取 (MFE) 算法处理的未知杂质的母离子和碎片离子的信息导入到安捷伦分子结构关联 (MSC) 软件，以便给出可能的分子结构。有关详细信息，请参阅安捷伦应用简报 5991-4404EN。我们发现在这 15 种杂质中，有三种杂质含有遗传毒性环氧化物和氢过氧化物官能团，这一结论与现有文献一致。我们将这些遗传毒性杂质的 MS/MS 碎裂图谱与已知的类似结构相比较，以此确认该发现。

通过馏分收集分离杂质

将 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统、Agilent 6150 单四极杆液质联用系统以及 Agilent 1260 Infinity 生物惰性馏分收集器相结合，用于分离复杂降解样品中的遗传毒性杂质的馏分。您可以放大这个分馏过程以获取足够量的杂质，然后通过 NMR 等技术作进一步的结构确认。

本研究表明，使用各种安捷伦硬件和软件解决方案能够成功地对药物强制降解产生的潜在遗传毒性杂质的结构进行鉴定。同时本研究还证明，您可以使用安捷伦喷射流离子源轻松监控热不稳定的遗传毒性杂质（如环氧化合物）。