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专用于生物分子分析的更优异的离子交换色谱

作者：Linda Lloyd
安捷伦生物色谱柱产品经理

离子交换 (IEX) 广泛应用于根据离子电荷不同分离生物分子。这是一种温和的、非变性技术，无需使用有机溶剂，因此经常用于表征天然或活性态蛋白质或用于蛋白质纯化。本文讨论了开发 IEX 方法时应当考虑的几个关键因素。关于这些因素及其详细内容，请参阅安捷伦新版的《专用于生物分子分析的离子交换色谱使用指南》。

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图 1. pH 值对蛋白质净电荷的影响

开发有效的离子交换方法

离子交换技术适合分离不同等电点的蛋白质，但也同样适合分离同一种蛋白质的不同电荷异构体。然而，必须牢记蛋白质（比如单克隆抗体）分子非常复杂，一个典型的 mAb 分子包含超过 1300 个不同的氨基酸，其中大约 130 个氨基酸含有酸性侧链，180 个含有碱性侧链，从而很可能在中性 pH 环境下带正电荷，因此可以采用阳离子交换色谱柱进行分离（图 1）。然而，对这样的复杂分子的实际等电点进行预测相当困难，所以需要进行适当的方法开发和优化。

样品前处理

IEX 的样品前处理与任何蛋白质分析的样品前处理均不同。最重要的一点是样品必须可溶于洗脱液并且应当非常适合溶于流动相中。为保护色谱柱免受可能的损害，样品在使用之前应当过滤以除去颗粒物，但不应通过过滤来补偿样品较差的溶解性 — 而应寻找其他的洗脱液。此外，应当配制新鲜的样品并尽快进行分析。冷藏可延长样品的保存时间和延迟细菌生长，否则细菌将在缓冲液中快速增长。

选择色谱柱填料

可供选择的 IEX 色谱柱很多。对于离子交换而言，首先需要考虑的应当是选用“阴离子交换还是阳离子交换”。再者，需要选择强离子交换或弱离子交换。在大多数情况下，最好先使用强离子交换色谱柱，然后根据需要采用弱离子交换剂以获得不同的选择性。选择阳离子交换或阴离子交换取决于目标蛋白质的等电点。

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图 2. 在 Agilent Bio WCX 色谱柱上进行蛋白质分离。通过更小填料粒径和更短色谱柱实现了更快速的分析 — 样品从较长色谱柱上洗脱下来需要 17 分钟，而从较短色谱柱洗脱仅需 12 分钟

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图 3. 通过 pH 筛选，使用动态混合四元梯度对三种蛋白质混合物进行分离

选择色谱柱

生物分子必须能够自由渗透到填料孔隙中。无孔球形颗粒能够使分析型分离获得最高的分离度，其中色谱柱上样量并非主要问题。考虑到填料粒径，使用较小粒径的填料可获得较高的分离度，但这样会导致背压升高。较短的 50 mm 色谱柱（尤其是填料粒径较小的色谱柱）可实现快速分离，而较长的 250 mm 色谱柱可进一步提高分离度（图 2）。内径较小的色谱柱有助于减少溶剂消耗量，较小的进样量有利于分析数量有限的样品。

流速

内径 4.6 mm 的色谱柱的典型流速为 0.5 至 1.0 mL/min，但对于某些应用而言，分析速度至关重要。若要缩短分析时间，可采用较短的色谱柱（以 50 mm 色谱柱代替常规的 150 mm 或 250 色谱柱）或提高流速或两者兼而有之（但注意不得超出色谱柱压力限值）。

流动相

流动相应当包含缓冲液以维持所需的操作 pH，通常为 20 mM。缓冲液的 pH 和离子强度会影响弱离子交换产物的分离度，因此应通过实验确定最佳条件（图 3）。向流动相中加入 NaCl 将会改变 pH，因此有必要进行重新调整。

色谱柱预处理和平衡

梯度设置中的色谱柱平衡和清洗阶段对于 IEX 的重现性至关重要。提高离子强度或改变洗脱液 pH 或同时执行这两种操作均可实现蛋白质洗脱，因此在每次分析结束时，色谱柱必须重新平衡，恢复其初始条件、离子强度和 pH。否则，下一次色谱柱运行将会得到不同的分析结果，因为蛋白质与色谱柱的相互作用发生了变化。

利用软件简化工作流程

安捷伦缓冲液顾问软件消除了繁琐且易于出错的方法开发步骤，包括缓冲液配制、缓冲液混合和 pH 值筛选，从而简化了工作流程。利用 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵的混合原理，缓冲液顾问软件有助于动态混合来自四种储备溶液的溶剂，简化您的生物分析工作流程，并显著减少缓冲液制备所需的时间。此外，缓冲液的配制更准确，将方法转移至其他实验室时更加稳定。

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