Access Agilent 电子期刊，2013 年 10 月

安捷伦 | Access Agilent 电子期刊，2013 年 10 月

利用毛细管电泳-电喷雾离子化质谱分析衍生自单克隆抗体的 N-糖链

作者：Suresh Babu CV
安捷伦应用科学家

糖基化是最重要的翻译后修饰之一，是蛋白质附加上多聚糖基团的过程。单克隆抗体 (mAb) 上的各种糖基化修饰对其生物活性和免疫原性具有重要影响。由于 mAb 作为治疗剂具有重要意义，因此针对附加至 mAb 的糖类结构的监测需求不断增长。

迄今为止，广泛用于分析 mAb N- 糖链的各种分析技术都面临着检测低含量多聚糖物种的严峻挑战。最近，毛细管电泳 (CE) 在糖蛋白质分析方面的应用备受关注，它能够在较短的运行时间内实现高效分离。另外，CE 与质谱仪 (MS) 的联用也引起了人们的广泛兴趣，两者联用可获得更高的灵敏度，并可通过精确的质量测量获得更好的化合物鉴定效果。

下文所述的应用将展示使用 CE/MS 平台对重组单克隆抗体 (mAb) 多聚糖的 N-连接糖链进行的分析。该方法包括利用 PNGase F 对 mAb 中的多聚糖进行酶裂解，然后用8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐 (APTS) 对多聚糖进行荧光标记。将 APTS 标记的多聚糖进行纯化后，使用 CE/MS 进行分析。

建立实验方案

实验采用了 Agilent 7100 毛细管电泳系统与 Agilent 6520 精确质量四极杆飞行时间 (Q-TOF) 质谱联用系统，该联用系统包含下列模块：

Agilent CE 系统（图 1）与配备双电喷雾离子源和正交共轴鞘流溶液接口的 Agilent 6520 Q-TOF LC/MS 系统联用。鞘流溶液由配有 1:100 分流器的等度泵进行输送。鞘流溶液主要用于将 CE 出口电连接到喷雾器的接地电位上，并确保电压始终施加在整个分离毛细管上，以便在恒定流速下获得稳定的电喷雾。

放大图片

图 1. 安捷伦毛细管电泳与 CE/MS 系统

放大图片

图 2. APTS 标记的 N-糖链（由 mAb 释放）的 CE/MS 分析结果

放大图片

表 1. 使用 CE/MS 对 mAb N-糖链进行鉴别的结果

鉴别 mAb 中的 N-连接糖链

图 2 中所示为释放自重组 mAb 的 N-连接糖链的 CE/MS 总化合物图谱。使用 PVA 涂层的毛细管，所有的 mAb 多聚糖可在 20 分钟的分离时间内完成迁移。不带电荷的 N-连接糖链 G0、G0F、G1、G1F、G2 和 G2F 在重复运行中得到成功鉴别。此外，实验还观察到单唾液酸化多聚糖基团 G2F+1NANA。所有的峰归属均基于 Q-TOF 分析的精确质量测量而完成。表 1 列出了本研究中鉴别出的多聚糖。

放大图片

图 3. 带 APTS 标记的 mAb N-糖链 CE/MS 质谱图

记录 N-连接糖链的质谱图和相对定量结果

绝对/相对多聚糖含量的估算在药物治疗产品的开发流程中至关重要。药物治疗产品对降解反应和任何微小的修饰都非常的敏感。

本实验中各分离多聚糖的质谱图如图 3 所示。其中标示了质谱图中观察到的丰度最高的电荷态。实验估算了相对于总化合物峰的体积百分比，mAb 所释放多聚糖的相对定量结果如表 1 所示。在本案例中，发现主要的糖型为 G2+1NANA。

这些结果清楚地表明 Agilent CE/MS 系统可作为一种有效的替代分析工具，用于监测多聚糖图谱。采用 CE/MS 联用系统进行分离只需极少的样品处理步骤，因而可避免污染；并且 CE 分离中所用的缓冲溶液可高度兼容电喷雾离子化。当前方法与传统的 CE-LIF 相比，在多聚糖分析方面具有更加灵敏和准确的优势。