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如何校准 GPC 色谱柱以获得最好结果

作者：Andrew Coffey 和 Richard Harmer
安捷伦 GPC 应用专家

使用窄分子量标准品校准 GPC/SEC 色谱柱，是一种考察聚合物分子量分布的行之有效的技术。当校准作为 GPC 方法开发不可或缺的一部分时，标准操作程序就应当始终采用最佳实践方案。以下是一些有用的操作指南，可确保您实现这一点。

选择合适的标准品和溶剂

校准标准品的选择取决于所使用的溶剂。表 1 所列的四种常规的标准品/溶剂组合涵盖了大多数应用。

表 1. GPC/SEC 溶剂及合适的校准标准品

安捷伦提供预包装的 GPC/SEC 校准试剂盒，其中包含 10 种不同分子量的物质 (0.5 g)，适用于在较宽的分子量范围运行的色谱柱组。对于较窄的分子量范围，可选择位于色谱柱运行极限附近的单个标准品。选择最小的多分散性非常关键；多分散指数 (D) 等于 1.20 是最低要求。较大的多分散标准品将导致重现性降低，因为每次进样的 Mp 将没那么明确。

正确前处理校准标准品

校准标准品必须正确地前处理，以免产生假峰或者得到错误的校准曲线，或造成过滤器和色谱柱滤头堵塞。标准品必须使用相同的流动相，该流动相应当能够滤除并具有高纯度。只要标准品溶液能完全溶解，就无需对其进行过滤。避免涡旋、超声或振荡，因为这些高剪切操作将改变峰形、保留时间和分子量。

标准品溶液的浓度也至关重要。浓度过高会导致样品粘度过大，从而使得组分的传质速度减慢和谱带增宽；而浓度过低会导致信噪比过低而无法实现可重现的积分。

仅在随机缠绕的聚合物链内外溶剂达到平衡时，才可得到真实的样品溶解度。较高分子量的标准品将花费更长的时间才可完全溶解，可能还需要加热以帮助溶解。然而，加热温度应当始终比溶剂沸点低 10 °C，以免发生热降解。

您需要多少种标准品？

通常采用十到十二个数据点构建校准曲线，以便获得准确的多项式回归结果。所用的标准品最好应当涵盖整个色谱柱组的分离范围以减少分子量计算过程中的外推误差，并提高长时间内校准样品与未知样品比较的可重现性。标准品应当包含未知化合物的整个分子量分布。如果无法校准整个分子量范围，则您应当使用具有线性扩展范围的色谱柱，例如 Agilent PLgel MIXED。您还应当使所有组分实现基线分离以获得最高的重现性。这样可以避免由于人为谱带增宽造成的保留时间漂移。为了实现基线分离，单一分子量标准品应当以 10 倍的差异进行分离。

分子量标准品通常作为混合物（包含三到四种标准品）进样，以缩短分析时间。当使用此类混合物校准有机和水性 GPC/SEC 时，Agilent EasiVial 提供了最快捷最简便的方法来实现色谱柱校准。预制备的试剂盒中包含三个以不同颜色标记的 2 mL 或 4 mL 自动进样器样品瓶，每个样品瓶内含有四种准确称量的聚合物标准品形成的混合物，从而只需进样三次即可获得包含十二个数据点的校准结果。

标准品可能一制备好即开始降解，因此规范操作是每周须制备新鲜的标准品。PEO 和 PEG 应当冷藏，但应当在使用前取出使其达到室温。

提高分离度和效率的策略

提高温度通常会导致流动相粘度降低，从而有助于提高分离度或者可以让您串联更多的色谱柱。最高操作温度取决于洗脱液沸点、样品稳定性及其他参数（包括色谱柱稳定性）。

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图 1. 增加 Agilent PLgel 色谱柱的数量能够改善基线分离度和峰高

填料粒径 <a> ( <a>祄 <a>)	GPC/SEC <a>色谱柱的数量
3	1 至 2
5 至 6	2 至 3
8 至 10	2 至 4
13 至 20	3 至 4

表 2. 填料粒径及其相应的 GPC 色谱柱的数量

采用填料粒径较小的色谱柱往往具有更高的效率。然而，填料粒径的选择取决于样品的分子量。使用填料粒径极小的色谱柱时，随着分子量增加可能发生剪切。此外，最佳流速将随填料粒径而发生变化。

如图 1 所示，增加串联的色谱柱数量是可行的，但色谱柱数量会受到压力的限制。在评价最合适的色谱柱组时，表 2 可作为开始阶段有用的参考。

您的工作决定了校准的频率

对于连续工作，您应当每天进行校准。不过如果使用内部验证，则应当每周进行校准。不论何时更换系统部件或洗脱液都需要重新校准。小贴士：通过为每个色谱柱组插入校准品可以保证最优的性能。这样将显著提高您对分析结果的信心。

合理的色谱柱校准提升自信心

GPC/SEC 是详细获知聚合物分子量分布的唯一成熟方法。这使得定期的色谱柱校准对于从仪器和色谱柱获得最佳的结果至关重要。安捷伦聚合物标准品是实现准确可靠的 GPC/SEC 色谱柱校准的理想参考物质。安捷伦为用户提供了众多有用的 GPC 资源，包括应用文集、基础导论和选择指南。让我们从阅读《GPC 色谱柱校准 — 最佳实践向导》开始吧！它完全免费，并提供了关于如何从 GPC 校准获得最佳结果的重要建议。

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