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二维液质联用系统中心切割法降低了药物杂质鉴定的方法开发需求

作者：Siji Joseph
安捷伦应用科学家

检测和鉴定活性药物成分 <a> (API) <a>中的杂质在制药行业中占据着重要地位， <a>LC/MS <a>则是一种经常选用的技术。 分析人员通常会从开发用于常规液相色谱检测器的方法入手，然后将其转换为 <a> LC/MS <a>方法。 需要注意的是，质谱仅限于使用挥发性缓冲液，因此，如果最始的液相色谱分离中使用了非挥发性的缓冲液，那么这会成为方法转换过程中的难题。 一种解决方案是，使用中心切割将杂质峰转移至使用挥发性缓冲液的第二个色谱柱中，以进行质谱分析。

最近，我们介绍了使用中心切割二维 LC/MS 进行相近洗脱杂质的分离。实验中将配备附加二元泵的 Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱系统和 Agilent 6540 四极杆飞行时间液质联用系统联用。

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图 1. 使用中心切割法进行杂质鉴定的工作流程。对于质谱分析，请使用为常规液相色谱检测器开发的液相色谱方法

数据处理由可进行杂质鉴定和结构解析的先进 <a> Agilent MassHunter <a>算法完成。 这些算法包括分子特征提取 <a> (MFE) <a>和分子式生成 <a>(MFG) <a>，以及 <a> MassHunter <a>分子结构关联计算 <a> (MSC) <a>工具。 通过鉴定度洛西汀药物中发现的杂质，我们对整个工作流程进行了介绍。

无需开发与质谱兼容的方法

我们使用一种与质谱不兼容、经验证的液相色谱方法来对度洛西汀 API 中的杂质进行分析，在接近主峰的尾部，洗脱出一种未知杂质。实验采用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18，4.6 × 250 mm，5.0 µm 色谱柱与泵 1 进行第一维分离。2 位/6 通色谱柱切换阀将该杂质转移到第二液相色谱柱中，然后，在第二液相色谱柱中我们使用来自第二个泵、与质谱兼容的流动相将其分离。

该方法无需开发与质谱兼容的液相色谱方法，通过 Agilent 6540 Q-TOF，我们获得了该杂质的精确质量数质谱和二级质谱数据。我们使用 Agilent MassHunter 工作站和安捷伦分子结构关联计算 (MSC) 软件进行数据处理，对该未知杂质进行了快速鉴定。图 1 展示了实验的工作流程。

在本实验中，我们使用了带喷射流离子源的 Agilent 6540 四极杆飞行时间液质联用系统以及带有以下模块和色谱柱的 Agilent 1260 Infinity 二元液相色谱系统：

• 用于第一维和第二维分离的 <a> Agilent 1260 Infinity <a>脱气机
• 用于第一维和第二维分离的两个 <a> Agilent 1260 Infinity <a>二元泵
• Agilent 1260 Infinity 高性能自动进样器
• 带 <a> 2 <a>位 <a>/6 <a>通色谱柱切换阀的 <a>Agilent 1260 Infinity <a>柱温箱
• 配有最大光强卡套式流通池（体积 4.0 µL，光程 60 mm）
  的 Agilent 1290 Infinity 二极管阵列检测器
• 色谱柱 1：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18，4.6 × 250 mm，5.0 µm
• 色谱柱 2：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18，4.6 × 75 mm，3.5 µm

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图 2. 中心切割之前、期间和之后的阀位。红色表示使用与质谱不兼容的流动相的流路 (1)，绿色表示使用与质谱兼容的流动相的流路 (2)

2 <a>位 <a>/6 <a>通色谱柱切换阀使中心切割更加简便易行

图 2 展示了中心切割方法中的阀位。使用方法 1 时，杂质在 8.7 min 时从色谱柱 1 中洗脱出来。然后，在 8.2 min 至 9.0 min 之间改变切换阀的位置，将该未知杂质转移至色谱柱 2 中。安捷伦应用简报 5991-1873CHCN 中提供有更多详细信息。

使用 <a> Agilent MassHunter <a>分子结构关联计算 <a> (MSC) <a>软件进行杂质鉴定

我们使用 MassHunter 定性分析软件的 MFE 和 MFG 算法进行数据分析。MFE 算法提取了所有样品组分的高分辨精确质谱图。从采集的数据中，MFE 算法会列出两个实体，其 m/z 值为 298.1257 和 312.1416。

MFG 算法将每个实体的一系列候选分子式列于表中，并根据它们的相对可能性进行了排序。我们将这两个实体的前体和碎片离子的精确质量数信息上传至 MSC 软件，并在 ChemSpider 数据库中进行搜索，以检索出所有可能的结构。检索结果确证 m/z 298.1257 与度洛西汀 API 相符，该未知杂质为度洛西汀的甲基衍生物。

了解如何获得以上这类分析结果

您可在安捷伦应用简报 5991-1873CHCN 中找到更多详细信息和结果。您也可与安捷伦客户服务中心联系，确保获得所需信息，以便鉴别药物中的未知杂质。立即了解我们一流的 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案的所有信息，轻松运用中心切割和全面的二维液相色谱应用。

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