战胜新型冠状病毒可用之利器，从抗病毒药物筛选到疫苗开发（二）
“新型冠状病毒”，一个月的时间，以超高速度到达全球每一个角落。冠状病毒与人类的斗争一直在持续，17 年前的 SARS、8 年前的 MERS，虽然疫情当时被克服，但其相关的抗病毒药物和疫苗都尚未研制成功！
面对新型冠状病毒以及类似病原体的不断升级进化，我们临床和科研迫切需要像流式细胞仪这种先进、全面的技术平台用于病毒致病机制研究、诊断治疗、药物研发和疫苗研制……
众所周知，流式细胞仪可对细胞或类似于细胞的颗粒表面和内部多种成分包括抗原、核酸、蛋白质等进行检测与分析，可检测多种标本如血液、血清、脑脊液、细胞培养液和肺泡灌洗液等，广泛应用于蛋白表达、免疫分型、细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖、细胞毒性、蛋白磷酸化、荧光蛋白、活性氧、细胞膜电位、细胞内钙离子浓度等检测。
面对新冠，流式有什么用？
免疫监测、病情评估、用药指导、预后评估
回顾SARS、MERS和2019-nCoV患者的临床数据，免疫受损的个体以及合并基础性疾病的患者是2019-nCoV易感且预后不良的人群。人体的免疫系统在疾病的发生、治疗和预后中发挥重要作用，免疫系统包括免疫器官，免疫细胞如淋巴细胞、树突状细胞（DC）、调节性T细胞等和细胞因子和趋化因子等。
除病毒本身的致病性外，机体的免疫反应在SARS、MERS 和 2019-nCoV 诱发的肺损伤中起着至关重要的作用。既往数据表明，伴随肺部炎症和肺损伤的SARS患者血清中大量表达促炎因子如IL-6、IFN-γ等，MERS患者同样出现 IFN-γ、TNF-α 等促炎因子升高，2019-nCoV 新冠肺炎患者中同时存在Th1和Th2型细胞因子增高，病情严重者甚至发生免疫系统过度反应即细胞因子风暴，导致患者死亡。
WHO、武汉同济医院、武汉协和医院、北京协和医院等发布的关于新型冠状病毒肺炎诊疗方案和指南中提到免疫检查和监测对于易感人群的筛查以及隔离观察、新冠肺炎患者病情监测、用药指导、预后评估、重症患者监测和用药的重要性。
Agilent 流式细胞仪体积法绝对计数无需绝对计数微球
流式细胞术在免疫功能监测和免疫状态评估方面具有绝对优势。Agilent NovoCyte流式细胞仪及配套TBNK淋巴细胞亚群检测试剂盒、IL-2/IL-4/IL-6/IL-10/TNF-α/IFN-γ检测试剂可无成本进行CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞、B和NK细胞的绝对计数和细胞因子的定量检查，从而辅助临床客观、准确地评估细胞和体液免疫功能、免疫状态，判断细胞因子和炎症反应的产生，预警预测细胞因子风暴。
SARS 患者中 TBNK 淋巴细胞亚群的绝对计数和百分比明显下降，监测淋巴细胞和淋巴细胞亚群有助于诊断和治疗 SARS。
Cui W, Fan Y, et al. Expression of Lymphocytes and Lymphocyte Subsets in Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome. Clin Infect Dis. 2003 Sep 15;37(6):857-9.
SARS 患者 IFN-γ、IL-10 和 IL-6 血清含量升高，SARS 死亡患者血清 Th2 型细胞因子显著高于痊愈患者，监测细胞因子对预测细胞因子风暴、评估患者预后提供指导。
Li CK, Wu H, et al. T Cell Responses to Whole SARS Coronavirus in Humans. J Immunol. 2008 Oct 15; 181(8): 5490–5500.流式细胞术可应用于细菌感染的诊断和鉴别诊断。中性粒细胞CD64感染指数是诊断细菌感染的一项敏感度高、特异性强的新指标，正常生理情况下中性粒细胞不表达或低表达CD64，中性粒细胞受到细菌细胞壁（脂多糖）刺激后膜表面CD64在1~6h内的表达迅速增加，检测新冠病毒肺炎患者中性粒细胞CD64感染指数可辅助临床诊断和鉴别诊断患者是否合并细菌感染。同时CD64感染指数与细菌感染的严重程度、预后及患者的死亡密切相关，监测CD64感染指数为评估病情、抗菌疗效和预后提供参考。
CD64 指数检测细菌感染具有敏感性高和特异性强的特点。
Schneider, A., Kurz, S., et al. Single organelle analysis to characterize mitochondrial function and crosstalk during viral infection. Sci Rep 9, 8492 (2019).Agilent流式细胞仪配合配套试剂检测新冠肺炎患者的中性粒细胞淋巴细胞亚群、细胞因子和CD64感染指数，监测免疫功能、免疫状态和细菌感染指标，可为临床监测病情、用药指导、疗效和预后评估提供参考，为脓毒症、细胞因子风暴提供个性化治疗方案，是抗疫工作中不可或缺的检测工具。
面对新冠，流式有什么用？
新冠病毒致病机理与特性研究
人体的免疫系统在病毒识别、致病和清除中发挥重要作用。人体对病毒的固有免疫反应在抑制病毒复制、促进病毒清除、诱导组织修复和激发适应性免疫中发挥重要的作用，同时固有免疫反应也会引起肺部和全身的炎症反应。宿主被病毒感染后可激发针对该病毒的免疫反应，机体细胞因子、趋化因子和免疫细胞发生改变，从而导致肺部和全身炎性反应。对冠状病毒和宿主免疫系统之间相互作用的深入了解可以揭示炎症发生的机制，从而为减少由冠状病毒引起的肺部炎症的药物研发和临床治疗提供理论支持。此外流式细胞仪结合聚苯乙烯荧光微球可用于病毒和细胞器水平的功能研究，如线粒体能量代谢、病毒检测、病毒群体识别和病毒颗粒的抗原特性等，为研发抗病毒靶向药物提供理论支撑和药效评估。
结合流式荧光抗体和病毒编码的荧光标记蛋白，利用流式细胞仪可区分感染和未感染个体的线粒体，同时表征线粒体多个参数如颗粒特征、膜电位等随时间的变化，监测病毒感染后线粒体颗粒特征、功能和能量代谢的变化以开发针对线粒体靶点的新型药物。
Schneider, A., Kurz, S., et al. Single organelle analysis to characterize mitochondrial function and crosstalk during viral infection. Sci Rep 9, 8492 (2019).面对新冠，流式有什么用？
抗病毒药物研发与疫苗研制
利用流式细胞仪研究病毒致病机理和病毒与人体的相互作用对于抗病毒靶向药物和相关免疫调节药物的开发至关重要。基于这些研究，临床和科研取得较大进展，如研发通过抑制氧自由基、细胞因子和趋化因子的产生释放等药物以改善患者肺部炎症和病变；联合用药如联合干扰素和环孢菌素A阻止病毒的核衣壳蛋白与人的环孢亲和素A相互结合，可抑制冠状病毒在人类支气管和肺部复制及造成的组织损伤；使用糖皮质激素、细胞因子拮抗剂等药物抑制细胞因子的释放、降低炎症因子的含量等可缓解患者肺部病变和炎症反应；最近国卫办《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）》及临床经验中提到部分中药对新冠肺炎的治疗有效，流式细胞仪可为阐明中药在治疗新冠肺炎中的作用机制提供技术平台。
开发疫苗保护人类免受毁灭性感染也是当前的迫切需求，对于许多传染病如冠状病毒、艾滋病毒、结核病和疟疾等，目前均没有高效的疫苗。疫苗研究取决于监测动物模型和参与临床试验的受试者的免疫反应，监测疫苗诱导的细胞免疫应答和抗体应答对于监测免疫原性至关重要，流式细胞仪处于疫苗研究的前沿。流式细胞仪在疫苗研究中主要作用有：
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研究疫苗功效和疾病发病机制；
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检测细胞纯度、免疫细胞表型、胞外细胞因子、胞内细胞因子以评价细胞免疫应答；
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监测细胞增殖、钙通量和活性氧的产生、细胞毒性杀伤和增殖能力以评估细胞功能。
综上，流式细胞仪可用于机理研究、疫苗筛选、临床试验功效评估和免疫学评价，在疫苗研究开发的整个流程中均发挥重要作用。
多色流式细胞术通过检测免疫细胞亚群表型、细胞增殖、细胞活化、细胞因子和免疫状态等以评估疫苗的免疫原性。应用示例：a通过CFSE荧光强度以评价不同疫苗接种次数后CD4+T细胞增殖能力，b通过检测经疫苗刺激后胞内细胞因子IL-2和IFN-γ的含量以评估疫苗诱导细胞免疫反应的能力。
Fadi Saade, Stacey Ann Gorski, et al. Pushing the frontiers of T-cell vaccines: accurate measurement of human T-cell responses Expert Rev Vaccines. 2012 December ; 11(12): 1459–1470.
利用流式检测胞内细胞因子（IFN-γ和TNF-α）评估SARS-Cov DNA疫苗诱导小鼠的CD4+和CD8+T细胞免疫反应的能力。
Yang, Z., Kong, W., et al. A DNA vaccine induces SARS coronavirus neutralization and protective immunity in mice. Nature 428, 561–564 (2004).Lynn GM, Sedlik C. et al. Peptide–TLR-7/8a conjugate vaccines chemically programmed for nanoparticle self-assembly enhance CD8 T-cell immunity to tumor antigens. Nat Biotechnol. 2020 Jan 13.
Agilent 最新的 Quanteon 流式细胞仪，最高可达 4 激光 25 色，最高上样速度可达 100,000 events/s，具备千余种临床和科研试剂，配套自动多功能数据分析软件 NovoExpress，能够同时检测多种免疫细胞的表型、状态和细胞因子以及病毒的生物学特征，可在临床前新药研发、免疫治疗、疫苗研发、毒理学、临床诊断治疗和临床基础研究中发挥重要作用。
参考文献：
1. 华中科技大学同济医学院附属同济医院《新型冠状病毒肺炎诊疗快速指南》
2. 华中科技大学同济医学院附属协和医院《武汉协和医院处置 2019 新型冠状病毒感染策略及说明》
3. 北京协和医院《北京协和医院关于“新型冠状病毒感染的肺炎”诊疗建议方案（V2.0)》
4. Chen Wang, Peter W Horby, et al. Emerging understandings of 2019-nCoV. Lancet. 2020 Jan 24.
5. Huang C, Wang Y, et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 2020 Jan 24.
6. Jasper Fuk Woo Chan, Shuofeng Yuan, et al. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet. 2020 Jan 24.
7. Ayman Mubarak, Wael Alturaiki, et al. Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV): Infection, Immunological Response, and Vaccine Development. Journal of Immunology Research 2019(1):1-11.
8. SC De Rosa. Vaccine applications of flow cytometry. Methods. 2012 Jul;57(3):383-91.
9. Cui W, Fan Y, et al. Expression of Lymphocytes and Lymphocyte Subsets in Patients with Severe Acute Respiratory Syndrome. Clin Infect Dis. 2003 Sep 15;37(6):857-9.
10. Li CK, Wu H, et al. T Cell Responses to Whole SARS Coronavirus in Humans. J Immunol. 2008 Oct 15; 181(8): 5490–5500.
11. Icardi M, Erickson Y, et al. CD64 index provides simple and predictive testing for detection and monitoring of sepsis and bacterial infection in hospital patients. J Clin Microbiol. 2009 Dec;47(12):3914-9.
12. Schneider, A., Kurz, S., et al. Single organelle analysis to characterize mitochondrial function and crosstalk during viral infection. Sci Rep 9, 8492 (2019).
13. Yang, Z., Kong, W., et al. A DNA vaccine induces SARS coronavirus neutralization and protective immunity in mice. Nature 428, 561–564 (2004).
14. Fadi Saade, Stacey Ann Gorski, et al. Pushing the frontiers of T-cell vaccines: accurate measurement of human T-cell responses Expert Rev Vaccines. 2012 December ; 11(12): 1459–1470.
15. Lynn GM, Sedlik C. et al. Peptide–TLR-7/8a conjugate vaccines chemically programmed for nanoparticle self-assembly enhance CD8 T-cell immunity to tumor antigens. Nat Biotechnol. 2020 Jan 13.
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安捷伦科技公司（纽约证交所：A）是生命科学、诊断和应用化学市场领域的全球领导者，拥有50多年的敏锐洞察与创新经验，我们的仪器、软件、服务、解决方案和专家能够为客户最具挑战性的难题提供更可靠的答案。2018财年，安捷伦营业收入为49.1亿美元，全球员工数约为15,550人。
关于安捷伦生物
安捷伦生物—原艾森生物,是生命科学研究高性能细胞分析平台的开发和商业化先驱。xCELLigence实时细胞分析技术和NovoCyte、Quanteon流式细胞仪广泛运用于新药研发、免疫治疗、疫苗研发、毒理学、安全药理学、质控和基础生命科学研究，目前，在全球范围内已安装3000多台仪器，并有2000多篇经同行专家评审的高水平学术文献中被引用。
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