헤드스페이스 샘플링은 가스 크로마토그래피(GC) 및 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC/MS)을 위한 일종의 시료 도입 기술입니다. 헤드스페이스 기술의 경우, 시료층 내의 볼퓸이 빠져나가는 것과는 대조적으로 바이알의 시료의 헤드스페이스 또는 가스층이 분석 되어집니다(그림 1). 헤드스페이스 분석을 위해서는 관심 화합물의 휘발성은 높고 시료의 나머지 부분은 휘발성이 훨씬 적거나 비휘발성이어야 합니다. 이 기술은 예를 들어 시료 유형이 고체, 점성 액체, 혈액 또는 약물인 경우 노동 집약적인 추출을 대체할 수 있습니다.
헤드스페이스 바이알은 종종 많은 액체 샘플링 시스템에서 사용되는 2mL 바이알보다 더 큰 부피로 제공됩니다. 일반적인 제품은 10mL, 20mL 및 22mL 용량입니다. 더 큰 바이알은 더 큰 시료량 및/또는 해당 시료 위의 더 큰 헤드스페이스를 수용합니다. 헤드스페이스는 휘발성 화합물에 가장 적합하기 때문에 고품질 바이알과 캡을 사용하여 단단히 밀봉하는 것이 성공적인 분석에 매우 중요합니다.
그림 1: 바이알 내의 시료 및 헤드스페이스 층을 표현한 것입니다.
GC 헤드스페이스의 이점
헤드스페이스 샘플링은 GC 분석에 여러 가지 이점을 제공합니다.
거의 모든 매트릭스와 호환됩니다. 시료 자체는 휘발성이거나 GC에 적합한 액체에 용해될 필요가 없습니다.
시료 전처리가 거의 또는 전혀 없습니다. 시료 전처리로 인해 전체 워크플로에 오류가 발생할 수 있기 때문에 재현성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.
더 작은 용매 피크. 많은 응용 분야에서 가스 크로마토그래프에 도입되는 용매의 양은 액체 주입의 용매보다 훨씬 적습니다. 이러한 경우, 용매 피크가 작아 관심 분석물을 방해할 가능성이 적습니다.
더 높은 기기 가동 시간. 시료가 더 깨끗하면 GC 주입구, 컬럼, 검출기 또는 질량 분석기 소스에 대한 유지보수가 줄어듭니다.
정밀도와 선형성이 우수하고 감도가 더 높은 경우가 많습니다.
헤드스페이스 샘플러의 핵심 부품
Agilent 7697A 및 8697 모델과 같은 밸브-앤-루프 헤드스페이스 샘플링 시스템은 다음과 같은 부품을 사용합니다.
온도 제어 오븐은 GC 실행이 시작되기 전에 일정한 온도에서 시료를 배양합니다.
샘플링 프로브는 바이알에 구멍을 뚫고 바이알 내에서 두 가지 조건이 일어나게 합니다: 1) 바이알 압력을 높이기 위한 가스 추가 및 2) 바이알에서 헤드스페이스 루프로 시료 이동.
가열된 샘플링 루프에는 반복 가능한 주입을 위해 고정된 양의 시료가 들어갑니다.
가열된 샘플링 밸브는 두 개의 개별 흐름 채널을 유지하여 교차 오염을 줄이고 GC로의 운반 가스 흐름이 방해받지 않도록 합니다.
가열된 이송 라인은 열 제어 채널을 통해 시료 내용물을 헤드스페이스 샘플러에서 GC로 이송하여 분석합니다.
헤드스페이스 샘플링 프로세스
시료는 헤드스페이스 분석에 적합한 바이알로 이송되고 휘발성 성분의 손실을 최소화하기 위해 즉시 캡이 씌워집니다. 헤드스페이스 바이알에 캡이 씌워지면 이러한 저비점 화합물이 시료와 헤드스페이스 층 사이를 이동하기 시작하여 궁극적으로 평형에 도달합니다(그림 2). 평형에 도달하는 시간은 시료에 따라 다르며 실험적으로 결정됩니다. 이 시간은 오븐 또는 기타 온도 제어 환경에서 바이알을 배양하여 최적화됩니다.
그림 2: 휘발성 성분이 시료 층 밖으로 이동하고 시료와 헤드스페이스 사이에 평형이 이루어지는 모습.
평형이 이루어지면 샘플링 프로세스를 시작할 수 있습니다. 밸브-앤-루프 설계(그림 3)에는 세 가지 기본 단계가 포함됩니다.
1단계에서는 추가 가스를 공급하여 바이알 내부의 압력을 높입니다.
2단계에서는 바이알 내부의 압력 중 일부를 배출하여 시료의 기체 상으로 시료 루프를 효과적으로 다시 채웁니다.
3단계에서는 샘플링 밸브를 돌려 시료를 이송 라인을 통해 GC 주입구로 주입하여 분석이 이루어지게 합니다.
최신 헤드스페이스 기기는 샘플링 프로세스를 완전히 자동화하고 대부분의 경우 특정 시료 유형에 최적의 시간과 압력을 실험적으로 결정하는 데 도움을 주는 도구를 갖추고 있습니다.
그림 3: 밸브-앤-루프 헤드스페이스 샘플러가 어떻게 작동하는지 보여주는 3단계 다이어그램.
성공적인 헤드스페이스 분석을 위한 중요 요소
GC 검출기 반응에 대한 헤드스페이스 농도의 관계를 나타내는 수학적 표현은 다음과 같습니다.
A ∝ CG = C0/(K + β)
이 수식은 검출기에 의해 발견된 면적(A)이 바이알의 기체 상에서 분석물 농도에 비례한다는 것을 보여줍니다. 이 농도(CG)는 추가된 시료(C0)의 농도를 시료에 특정한 두 개의 항인 분배 계수(partition coefficient, K) 및 상비(phase ratio, β)의 합으로 나누어 정의합니다. 검출기 반응을 최대화하려면 합계를 최소화할 목적으로 K 및 β에 대한 조건을 선택해야 합니다. 이렇게 하면 시료의 기체 상에서 휘발성 표적의 비례적 양이 증가합니다. 이를 위해 시료량과 분석물의 용해도를 최적화합니다.
시료량. 상비(β)는 바이알에 있는 기체상과 액체상의 상대적 부피로 정의됩니다(그림 4). 상비는 바이알 크기와 시료량의 영향을 받습니다. 상비를 최적화할 때 가장 좋은 방법은 바이알에서 헤드스페이스의 50% 이상을 남겨 두는 것입니다. 따라서 10mL 바이알 대신 20mL 바이알을 사용하면 더 많은 양의 시료를 사용할 수 있습니다(그림 5). 마찬가지로 동일한 크기의 바이알 내에서 시료량을 늘려도 β가 감소합니다(그림 6).
그림 4: 상비는 시료의 부피와 바이알 내부의 헤드스페이스를 비교합니다.
그림 5: 상비가 결과에 미치는 영향을 보여주기 위해 10mL 및 20mL 바이알에서 준비한 동일한 4mL 시료의 크로마토그래피를 중첩시켜 나타낸 모습.
그림 6: 10mL 바이알 내 다양한 시료량의 영향을 보여주는 크로마토그래피 오버레이.
시료 용해도. 헤드스페이스 결과는 분석물이 화학적으로 시료를 빠져나와 헤드스페이스로 이동할 수 있을 때 최적입니다. 이 측정값을 분배 계수(K)라고 하며, 이는 시료 농도(CS)와 기체상 농도(CG)를 온도에 종속적으로 표현한 것입니다. 이 비교를 그림 7에 설명했습니다. 액체 시료에서 K에 영향을 미치기 위해 용매 조정 또는 비휘발성 염 추가가 필수적일 수 있습니다. 고상 시료에서는 때로 소량의 용매가 분석에서 더 유리한 K 값을 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다.
그림 7: 분배 계수는 시료 내 특정 화합물의 농도를 헤드스페이스에 있는 동일한 분석물의 농도와 비교한 것으로 정의됩니다.
K에 미치는 온도의 영향을 보여주기 위해 그림 8에 온도 범위에서 20분 동안 평형을 유지한 시료의 크로마토그램을 나타냈습니다. 실행 온도가 높을수록 검출기 반응이 더 높으며, 이는 기체 상에 분석물이 더 많다는 것을 나타냅니다. 예를 들어, 40°C 물에서 에탄올의 K 값은 약 1350입니다. 80°C에서 K 값은 약 330으로 감소합니다. 일부 온도 설정값에서 검출기 반응은 온도가 증가함에 따라 더 이상 증가하지 않으며 이는 K가 최소화되었음을 나타냅니다. 최대 오븐 온도는 용매 비등점보다 약 20°C 낮게 유지해야 합니다.
그림 8: 20분 동안 서로 다른 온도에서 평형에 도달한 반복 시료의 크로마토그래피 오버레이.
다른 헤드스페이스 파라미터가 검출기 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 평형 시간, 바이알 진탕, 시료 루프 부피 및 시료 루프 압력과 같은 설정으로 분석의 일관성과 반복성을 향상시킬 수 있습니다. 이를 포함해 헤드스페이스 분석에 영향을 줄 수 있는 기타 요인에 대한 보다 자세한 설명은 이 웨비나를 시청하세요.
다중 헤드스페이스 추출을 사용하여 정확도 향상
위에서 설명한 헤드스페이스 샘플링 프로세스는 바이알당 한 번 추출이 이루어집니다. 그러나 헤드스페이스에 간섭 매트릭스가 있거나 동일한 매트릭스 조성으로 검량 표준물질을 만들 수 없는 경우 정량 결과가 정확하지 않을 수 있습니다. 다중 헤드스페이스 추출(MHE)에서는 동일한 바이알을 사용하는 일련의 샘플링 주기가 실행됩니다. 시료를 가압하고 헤드스페이스에서 분취량을 취하여 GC에 주입합니다. 이 과정을 반복하여 최종 결과를 얻습니다. 다중 헤드스페이스 농축(MHC)은 MHE와 동일하지만 헤드스페이스 분취량을 취할 때마다 GC에 주입하는 대신 극저온 트랩을 사용하여 시료를 GC 주입구에 농축합니다.
그림 9: 다중 헤드스페이스 추출.
GC 헤드스페이스의 일반 응용
잔류 용매
미국 약전(USP) 분석법 467은 일반적인 헤드스페이스 응용을 다룹니다. 이 분석법은 규제 지침을 충족하고 소비자 안전을 보장하기 위해 일반의약품 및 처방약에 존재할 수 있는 제약 제조 공정의 용매를 검출하고 측정합니다.
많은 지역과 국가에서 의료용 마리화나가 합법화됨에 따라 잔류 용매 분석이 대마 제품에도 사용되고 있습니다.
